基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术基于实时荧光PCR技术提供一种检测人细小病毒B19的引物、探针、试剂盒及方法。引物和探针由两组，第一组：模板1，如SEQ ID NO:7所示；正向引物1，如SEQ ID NO:1所示；逆向引物1，如SEQ ID NO:2所示；探针1，如SEQ ID NO:5所示；第二组：模板2，如SEQ ID NO:8所示；正向引物2，如SEQ ID NO:3所示；逆向引物2，如SEQ ID NO:4所示；探针2，如SEQ ID NO:6所示。本发明专利技术针对所有不同类型人细小病毒B19，设计对应的正反向引物、探针以及反应程序，建立一种具有良好专一性、灵敏性以及变异株高度覆盖性等优点的实时定量PCR法，且该检测方法适用于生物制品大批量生产的繁复检测。

Primers, probes, kits and methods for detection of human parvovirus B19 based on real-time PCR

【技术实现步骤摘要】
基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物、探针、试剂盒及方法
本专利技术所属生物检测领域，是运用体外核酸检测法检测生物制品中的病毒污染，特别是涉及一种利用实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物、探针、试剂盒及方法。
技术介绍
人细小病毒B19(HumanParvovirusB19)是一种能够引起人类多种疾病的非脂包膜单链DNA病毒，属于细小病毒科红病毒属。该病毒主要通过呼吸道分泌物、血液以及血液制品的方式进行传播。人群感染率高达60％-70％以上。孕妇感染该病毒时，易造成胎儿水肿和先天性贫血，严重时导致胎儿死亡；儿童感染该病毒时，会出现慢性溶血性贫血或传染性红斑。近年来大量研究表明诸如关节炎、肝炎、心肌炎、以及脑炎(尤其是儿童脑炎)等疾病可能与B19感染有关。B19病毒体积较小、无囊膜包裹、抵抗力较强，生物制品生产过程中的病毒清除工艺不能有效的将之清除，因而B19在生物制品中污染的可能性较高。为减少B19病毒对生物制品的污染，FDA指导原则要求人源细胞用于生物制品的生产时必须进行B19病毒的检测。生物制药公司非常需要一种具有良好专一性、灵敏性并能覆盖所有B19品系的检测方法。B19病毒的检测方法很多，主要包括抗体检测技术、抗原检测技术以及核酸检测技术。抗体检测技术不适用于培养细胞的检测；抗原检测技术检测灵敏度较低。核酸检测技术适用范围广，且灵敏度较高，是B19检测的一种较好的选择。该检测技术主要包括核酸分子检测技术和核酸分子扩增检测技术两种。目前，常用的核酸检测技术为实时定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)法。该方法指在PCR扩增过程中，通过荧光信号的强弱，对PCR产物进行实时检测，从而快速、高效、准确的检测出B19基因组DNA。检测生物制品中的B19病毒的方法需要尽可能多地覆盖B19的变异株。目前已报道的B19病毒qPCR检测方法均不能保证覆盖所有类型的B19，覆盖范围不足，用于B19病毒检测时易漏检，准确性低，结果可信度低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种覆盖范围广的检测B19病毒的qPCR检测方法，其能够覆盖所有类型的B19，具有良好专一性、灵敏性以及变异株高度覆盖性等优点，特别适用于细胞库中的B19病毒污染的检测以及生物制品大批量生产的繁复的质控检测。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物组合，包括：正向引物1：GTGGTGGTGAAAGCTCTGAA(如SEQIDNO:1所示)，逆向引物1：AGGAAACTGGGCTTCCGACA(如SEQIDNO:2所示)；正向引物2：GCTGATGTACAACAGTGGCT(如SEQIDNO:3所示)，逆向引物2：GTGTCTGTGACAATTGGGGT(如SEQIDNO:4所示)。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的探针组合，包括：探针1：TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATC(如SEQIDNO:5所示)；探针2：TGCAGATGCCCTCCACCCAGACCT(如SEQIDNO:6所示)。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的QPCR模板，包括：模板1：5’-GTGGTGGTGAAAGCTCTGAAGAACTCAGTGAAAGCAGCTTTTTCAACCTCATCACTCCAGGCGCCTGGAACAGTGAAACCCCGCGCTCTAGTACACCCGTCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATCATTTGTCGGAAGCCCAGTTTCCT-3’(如SEQIDNO:7所示)；模板2：5’-GCTGATGTACAACAGTGGCTTACATGGTGTAATGCACAAAGCTGGGACCACTATGAAAACTGGGCAATAAACTACACTTTTGATTTCCCTGGAATTAATGCAGATGCCCTCCACCCAGACCTCCAAACCACCCCAATTGTCACAGACAC-3’(如SEQIDNO:8所示)。本专利技术中提供的前述QPCR模板、引物、探针可相对应的分为两组：第一组：模板1，如SEQIDNO:7所示；正向引物1，如SEQIDNO:1所示；逆向引物1，如SEQIDNO:2所示；探针1，如SEQIDNO:5所示；第一组：模板2，如SEQIDNO:8所示；正向引物2，如SEQIDNO:3所示；逆向引物2，如SEQIDNO:4所示；探针2，如SEQIDNO:6所示。本专利技术提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的探针及引物的组合，包括：正向引物1：GTGGTGGTGAAAGCTCTGAA(如SEQIDNO:1所示)，逆向引物1：AGGAAACTGGGCTTCCGACA(如SEQIDNO:2所示)；正向引物2：GCTGATGTACAACAGTGGCT(如SEQIDNO:3所示)，逆向引物2：GTGTCTGTGACAATTGGGGT(如SEQIDNO:4所示)；探针1：TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATC(如SEQIDNO:5所示)；探针2：TGCAGATGCCCTCCACCCAGACCT(如SEQIDNO:6所示)。本专利技术提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的试剂盒，所述试剂盒包括引物和探针，所述引物为：正向引物1：GTGGTGGTGAAAGCTCTGAA(如SEQIDNO:1所示)，逆向引物1：AGGAAACTGGGCTTCCGACA(如SEQIDNO:2所示)；正向引物2：GCTGATGTACAACAGTGGCT(如SEQIDNO:3所示)，逆向引物2：GTGTCTGTGACAATTGGGGT(如SEQIDNO:4所示)；所述探针为：探针1：TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATC(如SEQIDNO:5所示)；探针2：TGCAGATGCCCTCCACCCAGACCT(如SEQIDNO:6所示)。具体的，所述试剂盒还包括预混液。所述预混液优选为TaqManUniversalMasterMix。具体的，所述试剂盒还包括QPCR模板。所述QPCR模板如SEQIDNO:7和/或SEQIDNO:8所示。具体的，所述试剂盒还包括HEK293细胞基因组DNA，可作为检测时的背景DNA使用。本专利技术提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的反应体系，所述反应体系包括以下成分：预混液：TaqManUniversalMasterMix(2×)；正向引物：如SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示；逆向引物：如SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示；探针：如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物组合，其特征在于，包括：/n正向引物1：如SEQ ID NO:1所示，/n逆向引物1：如SEQ ID NO:2所示；/n正向引物2：如SEQ ID NO:3所示，/n逆向引物2：如SEQ ID NO:4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物组合，其特征在于，包括：
正向引物1：如SEQIDNO:1所示，
逆向引物1：如SEQIDNO:2所示；
正向引物2：如SEQIDNO:3所示，
逆向引物2：如SEQIDNO:4所示。


2.一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的探针组合，其特征在于，包括：
探针1：如SEQIDNO:5所示；
探针2：如SEQIDNO:6所示。


3.一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的探针及引物的组合，其特征在于，包括：
正向引物1：如SEQIDNO:1所示，
逆向引物1：如SEQIDNO:2所示；
正向引物2：如SEQIDNO:3所示，
逆向引物2：如SEQIDNO:4所示；
探针1：如SEQIDNO:5所示；
探针2：如SEQIDNO:6所示。


4.一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物和探针，所述引物为：
正向引物1：如SEQIDNO:1所示，
逆向引物1：如SEQIDNO:2所示；
正向引物2：如SEQIDNO:3所示，
逆向引物2：如SEQIDNO:4所示；
所述探针为：
探针1：如SEQIDNO:5所示；
探针2：如SEQIDNO:6所示。


5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括预混液，所述预混液优选为TaqManUniversalMasterMix。


6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括QPCR模板，所述QPCR模板如SEQIDNO:7和/或SEQIDNO:8所示。


7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括作为检测时的背景DNA使用的HEK293细胞基因组DNA。


8.一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的反应体系，所述反应体系包括以下成分：
预混液：TaqManUniversalMasterMix(2×)；
正向引物：如SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示；
逆向引物：如SEQIDNO:2和SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：董元舒，刘存昌，苏财忠，童涌，
申请(专利权)人：苏州药明检测检验有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32