一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于RNA恒温扩增‑金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物‑‑‑特异探针‑‑‑金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。本发明专利技术没有RNA的提取过程，不需要特殊仪器，基于RNA恒温扩增，在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使甲、乙型流感病毒核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

A kit based on RNA constant temperature amplification and gold probe chromatography for the detection of influenza A and B viruses and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒及其应用。
技术介绍
流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。依据病毒颗粒外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为18个H亚型(H1-H18)和11个N亚型(N1-N11)，目前已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亚型有感染人的报道。由于编码HA和(或)NA的核苷酸序列容易发生突变，致使HA和(或)NA的抗原表位发生改变，这种抗原性的改变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。按照流行特点，造成人间流感流行的流感病毒可区分为季节性流感病毒和新型甲型流感病毒。季节性流感病毒通常在年度间发生小范围的基因变异，这种基因变异会导致微小的抗原性改变，称为抗原漂移(antigenicdrift)。因此，季节性流感病毒虽具有年度特异性且抗原性的改变使感染者不易获得持久免疫力，但传播范围通常局限于较小的人群范围，一般不会造成太高的发病率和死亡率，易感人群多为老年人(>65岁)和婴幼儿(<6岁)。在过去的几十年中，季节性流感病毒主要集中在甲型H3N2和H1N1亚型。近年来，新型甲型流感病毒亚型暴发流行的案例时有发生。例如，2009年新型甲型H1N1流感病毒造成全球性流感大流行；人感染高致病性禽流感(H5亚型)病毒的病例时有报道，禽类甲型H5N1亚型流感病毒被认为具有造成人间大范围流感流行的潜力。新型甲型流感病毒通常由于基因的节段性重组所致，这种大范围的基因改变易导致病毒抗原特性的重大改变，称为抗原转变(antigenicshift)。新型甲型H1N1流感病毒(2009)即同时包含了禽流感、猪流感和人季节性流感的基因片段从而导致病毒在抗原水平发生了明显改变。由于抗原性的明显改变以及可能由此造成的病毒毒力的增强，病毒的传染性和致病严重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的发病率和死亡率。流感病毒传播途径主要以空气飞沫传播为主，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒核酸检测试剂可用于流感的辅助诊断。现在常用的甲乙型流感病毒流核酸检测都是基于RT-PCR的方法，这些方法需要复杂的RNA提取过程，特殊的PCR扩增条件，专门的实验室和荧光定量PCR仪，而且在检测过程中极易产生污染。因此在RNA恒温扩增技术的基础上，结合胶体金层析技术，建立单管联合检测甲、乙型流感病毒核酸的方法具有非常重要的意义。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。因此，本专利技术没有复杂的RNA提取过程，也不需要特殊的仪器，基于RNA分子易降解的特点，本专利技术在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使甲、乙型流感病毒核酸检测得到广泛应用成为一种可能。为了实现上述目标，本专利技术采用如下技术方案：第一方面，提供一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒，包括：1)扩增反应液：含40mMTris-HCl(pH8.0)，12mMMgCl2，70mMKCl，15％DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM；其中扩增引物包括三对：甲型流感病毒、乙型流感病毒和人内参基因，具体的：(1)甲型流感病毒(NP基因一段保守区序列)的扩增引物：FluA-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGATGTCHTTCCAGGGGCGGG；注：本专利技术中的简并碱基H代表A/T/C；FluA-F引物(5’-3’)：TACTCCTCTGCATTGTCTCC；(2)乙型流感病毒(M基因一段保守区序列)的扩增引物：FluB-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACTGTTGGTTCGGTGGGA；FluB-F引物(5’-3’)：TTCCTGGTCTTTGGGTTTT；(3)内参基因(人18SrRNA一段保守区序列)的扩增引物：内参-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGACTTGCCCTCCA；内参-F引物(5’-3’)：AGAAACGGCTACCACATCC；由于甲流序列变异较大，在设计引物时必须保证能够扩增出所有常见的亚型流行株核酸，本专利技术在设计甲流扩增引物时R引物设计成简并碱基，对甲流常见流行株进行了全覆盖。在设计引物时同时要保证各自单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰。三对引物的R引物5’端都引入了T7RNA聚合酶启动子序列。2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如AMV或M-MLV)、T7RNA聚合酶和RnaseH；3)细胞裂解液(购至美国Signosis公司，货号CL-0001)：可以裂解细胞，释放核酸；4)检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸探针(金探针)、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：(1)甲型流感病毒特异探针(5’-3’)甲流CES1：TTCCAGGGGCGGGGAGttttTATCTATAGCTGGTGT；甲流CES2：TCTTYGAGCTCTCGGAttttTATCTATAGCTGGTGT；注：本专利技术中的简并碱基Y代表T/C；甲流LES1：CGAAARGGCARCGARCttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；注：本专利技术中的简并碱基R代表A/G；甲流LES2：CCGATCGTGCCYTCCTttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；甲流LES3：TTGACATGARTAAYGAttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；(2)乙型流感病毒特异探针(5’-3’)乙流CES1：AAGAATTTGACCTAGACTttttCTATGTATCTGTGAGT；乙流CES2：CTGCCTTGGAATGGATAAttttCTATGTATCTGTGAGT；乙流LES1：AAAACAAAAGATGCTTAAttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；...

【技术保护点】
1.一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：/n1）扩增反应液：含40 mM Tris-HCl (pH 8.0)，12 mM MgCl

【技术特征摘要】
1.一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1）扩增反应液：含40mMTris-HCl(pH8.0)，12mMMgCl2，70mMKCl，15%DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2µM，其中扩增引物包括三对：甲型流感病毒、乙型流感病毒和人内参基因，具体的：
（1）甲型流感病毒的扩增引物：
FluA-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGATGTCHTTCCAGGGGCGGG；其中，H=A/T/C；
FluA-F引物（5’-3’）：TACTCCTCTGCATTGTCTCC；
（2）乙型流感病毒的扩增引物：
FluB-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACTGTTGGTTCGGTGGGA；
FluB-F引物（5’-3’）：TTCCTGGTCTTTGGGTTTT；
（3）内参基因的扩增引物：
内参-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGACTTGCCCTCCA；
内参-F引物（5’-3’）：AGAAACGGCTACCACATCC；
2）扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7RNA聚合酶和RnaseH；优选地所述逆转录酶为AMV或M-MLV；
3）细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001；
4）检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸金探针、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：
（1）甲型流感病毒特异探针（5’-3’）
甲流CES1：TTCCAGGGGCGGGGAGttttTATCTATAGCTGGTGT；
甲流CES2：TCTTYGAGCTCTCGGAttttTATCTATAGCTGGTGT，
其中，Y=T/C；
甲流LES1：CGAAARGGCARCGARCttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；
其中，R=A/G；
甲流LES2：CCGATCGTGCCYTCCTttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；
甲流LES3：TTGACATGARTAAYGAttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；
（2）乙型流感病毒特异探针（5’-3’）
乙流CES1：AAGAATTTGACCTAGACTttt...

【专利技术属性】
技术研发人员：李先强，姜昕，陈巨，黄永伟，
申请(专利权)人：武汉中帜生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42