本发明专利技术公开了一种快速三维超分辨率显微方法，包括：激光光束在准直后转换为线偏振光，对线偏振光进行相位调制并转换为圆偏振光投射到待测样品上，以及收集待测样品各扫描点发出的信号光；对样品进行三维扫描，所述的相位调制包括一次相位调制和二次相位调制；一次相位调制采用对线偏振光s光分量进行相位调制的空间光调制器，二次相位调制采用对线偏振光p光分量进行相位调制的空间光调制器，最后根据有效信号光强得到三维超分辨图像。本发明专利技术还公开了一种快速三维超分辨率显微装置。本发明专利技术使用较低的光功率，减弱光漂白效应，快速的三维成像，装置简单，无需分光。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于超分辨领域，尤其涉及一种能在远场快速实现三维超衍射极限分辨率 的方法和装置。
技术介绍
光学显微成像是一种常用的、有效的观测亚微米级微观结构的手段，然而光学衍 射极限的存在极大限制了光学显微成像的分辨率。根据阿贝衍射极限原理，理想点光源经 过显微物镜聚焦后不是成一个理想像点，而是一个衍射光斑，其尺寸用衍射斑强度分布曲 线的半高全宽来衡量，式中λ为显微镜所使用的照明光波长，NA为所使用显微物 镜的数值孔径，由于NA = n sina，式中η是被观察物体与物镜之间介质的折射率，α是物镜孔 径角(物镜光轴上的物点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度)的一半，ΝΑ值约为1，因此 衍射斑尺寸最小约为工作波长的一半，这也是常规光学显微成像的极限分辨率。对于更加 精细、微小的微观结构，常规光学显微成像的方法就有所受限。 1990年共聚焦显微镜的提出，是光学显微领域的一次革命。共聚焦显微镜利用一 个小孔进行空间滤波，能够将分辨率提高2倍，且能提高显微图像的信噪比和对比度，另外， 共聚焦显微镜还有光学切片能力，使高精度三维成像变为可能。虽然共聚焦显微镜仍受到 光学衍射极限的限制，但它是后来提出的很多超越衍射极限的光学显微方法的基础。 在共聚焦显微镜提出后二十年里，有多种超分辨光学显微方法被提出，比如结构 光照明焚光显微术（SIM:Structured Illumination Microscopy)、光活化定位显微术 (PALM:Photo_activated Localization Microscopy)、随机光场重建显微术（STORM: Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)、受激发射损耗显微术（STED: Stimulated Emission Depletion Microscopy)、焚光受激微分显微术(FED:Fluorescence Emission Difference Microscopy)等。其中焚光受激微分显微术(FED)是最近提出的一种 新颖的超分辨成像手段，它在共聚焦显微镜的基础上，利用两种不同模式的激发光激发产 生荧光图像的强度差异实现超分辨，是一种差值成像法。差值成像法是在数十年前被提出 的，通过相同激发光下不同尺寸小孔收集的共焦信号差异，可以提高一定程度的分辨率，但 此种方法的信噪比比较低。为了克服此缺陷，科研工作者提出了荧光受激微分显微术和激 光模式切换显微术(SLAM:Switching Laser Mode Microscopy)，通过利用相同尺寸小孔、 不同模式的激发光下收集到的荧光信号差异实现超分辨。荧光受激微分显微术采用横向不 同强度分布的两种模式的激发光交替照明荧光样品，一种是实心光斑，另一种是面包圈状 的中空光斑，其中心是一个尺寸小于衍射极限的暗斑，通过差值消除边缘激发的信号光，提 取中心小于衍射极限区域激发的信号光，继而达到超越衍射极限的分辨率。 例如，现有公开号为CN 102735617 A的专利文献公开了一种超分辨显微方法，包 括:将激光器发出的激光光束准直后转换为线偏振光;线偏振光经第一次相位调制后进行 光路偏转;偏转后的光束经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，收集待测样 品各扫描点发出的信号光，得到第一信号光强;切换调制函数，对线偏振光进行第二次相位 调制后投射到待测样品上，收集待测样品各扫描点发出的信号光，得到第二信号光强;计算 有效信号光强，并得到超分辨图像;该显微方法仅可实现二维成像。 荧光受激显微术具有低功耗、弱漂白、成快像、光路简单等优点，但当其应用于三 维超分辨率显微成像时，需要将激发光分为三路分别调制，再将调制完毕的三路光进行合 束，这无疑大大增大了光学显微系统的空间复杂度。另外，还需要设计三路快门开关控制激 发光模式的切换，也大大增大了显微系统的时间复杂度。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速三维超分辨显微方法和装置，可以在远场快速实现三维的 超越衍射极限的分辨率;该种方法和装置具有成像速度快、三维成像、装置简易、分辨率高 等特点，可以很好的应用于荧光样品的检测之中。 本专利技术的具体技术方案如下： 一种快速三维超分辨率显微方法，包括以下步骤： 1)将激光器发出的激光光束准直后转换为线偏振光； 2)对所述线偏振光进行相位调制，调制函数为，其中p为光束上某点与 光轴的距离，Φ为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角； 3)将所述相位调制后的线偏振光进行光路偏转； 4)偏转后的光束转换为圆偏振光经准直和聚焦后投射到待测样品上，以实现对待 测样品的二维扫描，沿z轴方向移动待测样品，以实现对待测样品的三维扫描； 5)在三维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到 第一信号光强Ii(x，y，z)，其中X，y，z为扫描点的三维坐标； 6)对步骤2)中所述线偏振光的s光分量进行相位调制，调制函数为.（(A的= <?，其 中P为光束上某点与光轴的距离，9为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角； 7 )对步骤2 )中所述线偏振光的ρ光分量进行相位调制，调制函数为，其中Ρ为光束上某点与光轴的距离，PQ为光束半径，Φ为光束垂直 光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角； 8)重复步骤3)和步骤4)，对步骤5)中的各扫描点进行第二次扫描，收集得到的第 二信号光强I 2(x，y，z)，其中x，y，z为扫描点的三维坐标； 9)根据公式1(1，7,2) = 11(1，7,2)-丫12(1，7,2)计算有效信号光强1(1，7,2)，并利 用I(x，y，z)得到超分辨图像，其中，为第一信号光强ΙΚχ,Υ,ζ)中的最大值， /Γχ为第二信号光强12(1，7,2)中的最大值。 本专利技术中，待测样品上的x，y，z轴方向由三维扫描方向决定。 其中，所述有效信号光强I (X，y，Z)为负值时，将其设为零值。本专利技术提供一种快速三维超分辨显微装置，包括光源、承载待测样品平台和将光 线投射到所述样品平台的显微物镜等，所述光源与显微物镜之间依次设有：用于将所述激光光束滤波和准直的单模光纤和准直透镜；用于将所述滤波和准时后的激光光束转变为线偏振光的起偏器； 用于调节所述线偏振光s光和p光分量比例的1/2波片； 用于对所述线偏振光s光分量进行相位调制的空间光调制器； 用于对所述线偏振光p光分量进行相位调制的空间光调制器； 用于对所述相位调制后的光束进行光路偏转的扫描振镜系统； 用于对所述扫描振镜系统的出射光束进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜； 用于将准直之后的光束转换为圆偏振光的1/4波片； 所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上。 所述待测样品固定在纳米位移平台上，用于对所述待测样品进行轴向扫描。 并设有用于控制所述空间光调制器、扫描振镜系统和纳米位移平台的控制器及收 集所述待测样品发出的信号光的探测系统。探测系统包括： 布置在空间光调制器和扫描振镜系统之间的二色镜； 用于滤去通过二色镜信号光中的杂散光的带通滤波片；用于探测信号光束光强信号的探测器，所述探测器选用雪崩二极管(APD); 用于将所述滤光过的信号光束聚焦到探测器上的会聚透镜； 用于对所述信号光束进本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速三维超分辨率显微方法，包括：激光光束在准直后转换为线偏振光，对线偏振光进行相位调制并转换为圆偏振光投射到待测样品上，以及收集待测样品各扫描点发出的信号光；其特征在于：对样品进行三维扫描，所述的相位调制包括一次相位调制和二次相位调制；所述的一次相位调制和二次相位调制的调制函数均为时，收集所述的信号光得到第一信号光强I1(x,y,z)，x,y,z为扫描点的三维坐标；所述的一次相位调制的调制函数为且所述的二次相位调制的调制函数为时，收集所述的信号光得到第二信号光强I2(x,y,z)，x,y,z为扫描点的三维坐标；其中：ρ为光束上某点与光轴的距离，ρ0为光束半径，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；根据I1(x,y,z)和I2(x,y,z)计算有效信号光强I(x,y,z)，并利用I(x,y,z)得到三维超分辨率显微图像。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘旭，荣子豪，赵光远，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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