一种检测猴T细胞嗜淋巴细胞病毒的引物和探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测猴T细胞嗜淋巴细胞病毒的引物和探针组合及其应用，所述引物和探针组合包括检测猴T细胞嗜淋巴细胞病毒tax基因的引物和探针组合；所述引物和探针组合包括：正向引物、反向引物和探针；所述正向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示；所述探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术针对所有不同类型猴T细胞嗜淋巴细胞病毒，设计对应的正反向引物、探针以及反应程序，建立一种具有良好专一性、灵敏性以及变异株高度覆盖性等优点的实时定量PCR法，且该检测方法适用于生物制品大批量生产的繁复检测。用于生物制品大批量生产的繁复检测。用于生物制品大批量生产的繁复检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测猴T细胞嗜淋巴细胞病毒的引物和探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测猴T细胞嗜淋巴细胞病毒的引物和探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]猴T细胞嗜淋巴细胞病毒(Simian T
‑
cell Lymphotropic Virus，STLV)于1982年首次在日本猕猴中发现，之后在亚洲和非洲超过20种非人灵长类中发现了STLV。恒河猴和食蟹猴中也发现有STLV
‑
1血清阳性抗体存在。猴T淋巴细胞白血病病毒(simianT
‑
lymphotropicvirus，STLV1)，与人T淋巴白血病病毒(humanT
‑
lymphotropicvirus，HTLV)统称为灵长类嗜T淋巴细胞病毒(primateT
‑
lymphotropicvirus，PTLV)，均属于逆转录病毒属。
[0003]人工繁殖猴和野生猴均可被STLV感染，但无临床症状表现。受STLV感染的非洲绿猴出现了与受HTLV感染的人相似的贫血症，并且STLV1与人的HTLV的遗传同源性高达90
‑
95％。生物制品的出现对人类的健康和生活质量的提高有非常特殊的意义。随着生物医药的发展，非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)在疫苗生产中被大量使用，其质量直接影响生物制品的质量安全，特别是病毒类生物活性物质污染会严重影响制品的质量安全。同时，非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)作为人源、灵长类病毒感染指示细胞之一，在细胞系病毒感染筛查实验中大量使用。因此，需要开发一种建方便、快捷、灵敏、特异性强的检测方法。
[0004]STLV病毒的检测方法很多，主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)法、间接免疫荧光(IFA)等。但该方法特异性差，灵敏度低，需要结合免疫印迹(WB)法才能进行确诊，而WB法步骤繁琐，操作复杂，非一般人员可进行操作，在一定程度上限制了其应用范围。核酸检测技术适用范围广，且灵敏度较高，是STLV检测的一种较好的选择。该检测技术主要包括核酸分子检测技术和核酸分子扩增检测技术两种。
[0005]目前，常用的核酸检测技术为实时定量PCR(Quantitative Real
‑
time PCR)法。该方法指在PCR扩增过程中，通过荧光信号的强弱，对PCR产物进行实时检测，从而快速、高效、准确的检测出STLV基因组RNA。
[0006]CN106244730A公开了一种猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT
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LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。检测的引物组包括一对外引物、一对环引物、一对内引物；检测试剂盒包括引物组、RT
‑
LAMP反应液、BstDNA聚合酶、逆转录酶、阴阳性对照。其检测方法是通过提取待检病毒RNA，在逆转录酶的作用下对RNA进行反转录，然后采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在63～65℃对样品模板进行扩增，通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或电泳是否有梯状条带来确定待检样品中是否含有猴嗜T淋巴细胞病毒I型(STLV
‑
I)RNA。检测生物制品中的STLV病毒的方法需要尽可能多地覆盖STLV的变异株。目前已获得专利的STLV病毒qPCR检测方法均不能保证覆盖所有类型的STLV。
[0007]因此，提供一种能够高效、准确地检测出所有类型的STLV RNA，并且不受大量背景
细胞RNA的影响的STLV病毒核酸检测方法具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0008]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测猴T细胞嗜淋巴细胞病毒的引物和探针组合及其应用。本专利技术针对所有不同类型猴T细胞嗜淋巴细胞病毒STLV，设计对应的正反向引物、探针以及反应程序，建立一种具有良好专一性、灵敏性以及变异株高度覆盖性等优点的实时定量PCR法，且该检测方法适用于生物制品大批量生产的繁复检测。
[0009]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种检测猴T细胞嗜淋巴细胞病毒的引物和探针组合，所述引物和探针组合包括检测猴T细胞嗜淋巴细胞病毒tax基因的引物和探针组合；
[0011]所述引物和探针组合包括：正向引物、反向引物和探针；
[0012]所述正向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示；
[0013]所述探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示。
[0014]SEQ ID NO:1：TGGTGCCCCATYWCHGG。
[0015]SEQ ID NO:2：GGAGBCGAGGGATAAGG。
[0016]SEQ ID NO:3：FAM
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ACCTGGGACCCCATYGA
‑
MGB。
[0017]本专利技术中，通过对NCBI数据库中STLV所有分离株(包括STLV1、STLV2和STLV3)共67条基因序列(长度大于全基因组碱基数的80％)做同源性比对，设计出1组实时定量PCR的正反向引物以及探针，所述引物和探针组合能够高效、准确地检测出所有类型的STLV RNA，并且不受大量背景细胞RNA的影响，特别适用于检测生物制药原料和产品，尤其是细胞库中的STLV病毒污染。
[0018]优选地，所述探针的5
’
端修饰荧光素，所述探针的3
’
端修饰淬灭剂；
[0019]优选地，所述荧光素选自FAM、VIC或HEX任意一种；
[0020]优选地，所述淬灭剂选自MGB、BHQ1或TAMRA任意一种；
[0021]优选地，所述正向引物和反向引物扩增的目的片段的序列如SEQ ID NO:4所示。
[0022]SEQ ID NO:4：
[0023]TCCTCTTTCTCCCGCTCTCTTTTTCGCTTCCTCTTCTCCTCAGCCCGTCGCTGCCGATCGCGATACGTCTCCCCGCGAGGTGGCGTCTCCTCCCTTAGAGGGACCCGTTGCTGCTGGCCATAACATTCCTCTTCTAGGGATAGCAAACCGTCAAGCACGGACTCCTCCTCCGTCCTTTGCTTGTTTAAGTCCTCTTCTAGGGATATTAGTCCGTCCACCAAGTCATCCACCAGCAGGTCCTCCGGGCAGGGAACAGGTAAACATCGAAACGGCCCTACACATACAAAATTAATCATATTTATTATCAGCCCATTTCCCAGGTTTTGGACAGAGCCTTCTTTATGGATACCCAGTCTACGTATTTGGAGACTGTGTGCAAGGCGACTGGTGCCCCATCTCTGGGGGACTATGCTCGGCCCGCCTGCACCGTCACGCCCTACTGGCCACCTGTC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
Mix 1
×
、800
‑
900nM正向引物、800
‑
900nM反向引物、220
‑
250nM探针；所述荧光定量PCR反应的程序包括：步骤1：52
‑
56℃，28
‑
32min；步骤2：94
‑
96℃，8
‑
12min；步骤3：94
‑
96℃，13
‑
17sec；步骤4：58
‑
62℃，0.8
‑
1.2min；步骤3和步骤4，40<...

【专利技术属性】
技术研发人员：董元舒，沈施佳，贾雪卿，朱大鹏，童涌，
申请(专利权)人：苏州药明检测检验有限责任公司，
类型：发明
国别省市：