病毒纯化制造技术

本发明专利技术公开了用于生产反转录病毒或慢病毒载体制剂的方法，该方法包括过滤除菌步骤，其中该过滤除菌步骤不是纯化方法中的最后步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】病毒纯化专利
本专利技术涉及反转录病毒载体生产和纯化的改进方法。专利技术背景基因治疗技术的成功有赖于能够以对人体安全的方式实现转移的基因的充分表达。反转录病毒常常用作递送系统(或者称为递送介质或递送载体)，用来(尤其是)将某种目的核苷酸(NOI)或多种目的核苷酸转移到一个或多个目的位点。人们对慢病毒载体系统的开发也表现出极大的兴趣，因为慢病毒能够感染非分裂细胞(Lewis&Emerman(1993)J.Virol.68：510)。另外，慢病毒载体使得目的基因能够得到非常稳定的长期表达。对于体内转导的大鼠神经元细胞来说，这已证实为至少一年(Bienemann等人.(2003)Mol.Ther.5：588)。载体纯化过程是临床基因转移治疗中的一个重要步骤，就纯度和滴度而言与安全性和功效直接相关。在大多数小规模的实验应用中，可采用离心技术通过相对简单的方法来浓缩和纯化载体。但是，将纯化方法进行放大以便为临床使用进行大规模生产，这是一个重大挑战。具体地讲，当考虑生产人用载体时，必须采取诸如过滤除菌的额外步骤来确保载体制品的纯度和安全性。载体制备方法一般包括从稳定或短暂产生载体的细胞获取载体和使用例如色谱法纯化病毒载体。在工业过程中，最后一个步骤是灭菌步骤，并且在灭菌步骤之前通常使用至少一个超滤步骤以浓缩病毒载体和/或交换保持病毒载体的缓冲液。有几个出版物描述了从细胞纯化病毒，其中大多数讨论了使用特异性色谱基质来从细胞裂解物纯化病毒。例如，美国专利No.6,261,823和美国专利No.5,661,023公开了包括使用单独的阴离子交换树脂的方法，而美国专利5,837,520公开了阴离子交换接着是亲和色谱的这样一种相续组合。Yamada等人证实用阴离子交换HPLC纯化慢病毒载体能使基因转移得到改善(Yamada等人.(2003)Biotechniques34(5)：1074-8，1080)。仍需要能产出纯产品而又能保持高滴度的大规模反转录病毒载体纯化方法。本专利技术解决了这个需求。专利技术概述我们证明了，出乎意料的是，当过滤除菌步骤不是生产过程中的最后步骤时，可实现生产反转录病毒和慢病毒载体制剂的改进方法。具体地讲，我们发现了在浓缩步骤(例如通过超滤)之后进行过滤除菌步骤会导致病毒载体滴度相当大的损失。这是出乎预料的，因为反转录病毒颗粒的直径在80-120nm的范围内，因此它们应当容易通过除菌过滤器的孔道；对于含有载体的细胞培养物上清液来说这的确如此，这种上清液进行常规过滤没有观察到功能滴度的损失。因此不清楚为什么一旦载体制品经过了加工就不再可能做到对制品进行过滤除菌而又不损失回收率。此外，我们出乎预料地发现，如果在过滤除菌步骤之后进行最后的浓缩步骤，可获得载体颗粒收率的增加。这与确立的病毒生产方法是相反的，在这些生产方法中浓缩步骤传统上是在过滤除菌步骤之前进行的。我们还发现了，在过滤除菌之前例如通过稀释载体颗粒制品来维持合适的载体颗粒浓度，也能改进载体颗粒收率。出乎预料的是，在该方法中的一些阶段中降低载体颗粒浓度可实际上最终导致产品收率提高。应理解，可通过无菌稀释由本专利技术方法生产的制剂来生产较低剂量的制剂。本专利技术的生产方法优选是用于生产适合作为治疗剂给予人体的临床级制剂的大规模方法。本文所述的反转录病毒和慢病毒载体制剂优选适合作为治疗剂给予人体。本专利技术的第一方面提供包括过滤除菌步骤的反转录病毒或慢病毒载体制剂生产方法，其中该过滤除菌步骤不是该生产方法中的最后步骤。优选地，反转录病毒载体是慢病毒载体。优选地，过滤除菌步骤在浓缩步骤之前进行。优选地，浓缩步骤是该方法中的最后步骤，而过滤除菌步骤是该方法中的倒数第二个步骤。优选地，浓缩步骤用超滤、优选切向流过滤、更优选中空纤维超滤来进行。优选地，过滤除菌步骤用最大孔径大小为约0.22μm的除菌过滤器进行。在另一个优选的实施方案中，最大孔径大小为0.2μm。在优选的实施方案中，为使EIAV颗粒的回收率达到最佳，在过滤除菌之前载体浓度应小于或等于约4.6x1011个RNA基因组拷贝/ml制品。该适当浓度水平可通过使用例如稀释步骤(如果适当的话)控制载体浓度来实现。因此，在一个实施方案中，在过滤除菌之前将反转录病毒载体制品进行稀释。因此，如果技术人员碰到载体颗粒回收率低于预期的情况，他应考虑在过滤除菌之前先降低载体颗粒的浓度。实现最佳回收率的适当滴度水平可用下文(具体而言实施例部分)描述的技术来确定。本专利技术的第二方面提供生产反转录病毒载体制剂的方法，该方法按时间顺序包括以下步骤(i)至(vi)：(i)培养能产生反转录病毒载体的细胞；(ii)收获含有反转录病毒载体的上清液；(iii)任选澄清上清液；(iv)纯化反转录病毒载体以得到反转录病毒载体制品；(v)对反转录病毒载体制品进行过滤除菌；和(vi)浓缩反转录病毒载体制品以生产出最终的批量产品。在一个实施方案中，该方法不包括澄清步骤(iii)。在另一个实施方案中，该方法确实包括澄清步骤(iii)。优选地，步骤(vi)用超滤、或切向流过滤、更优选中空纤维超滤来进行。优选地，步骤(iv)中的纯化方法是离子交换色谱，更优选是阴离子交换色谱。优选地，步骤(v)中的过滤除菌用0.22μm或0.2μm除菌过滤器进行。优选地，步骤(iii)通过过滤澄清来进行。优选地，步骤(iv)用选自色谱、超滤/渗滤或离心的方法或这些方法的组合来进行。优选地，色谱方法或方法组合选自离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、反相色谱和固定化金属离子亲和色谱。优选地，离心方法选自区带离心、等密度离心和粒化离心(pelletingcentrifugation)。优选地，超滤/渗滤方法选自切向流渗滤、搅拌池渗滤(stirredcelldiafiltration)和透析。优选地，在本专利技术方法中包括至少一个用以降解核酸以改善纯化的步骤。优选地，所述步骤是核酸酶处理。优选地，所述核酸酶是Benzonase核酸酶。优选地，(一个或多个)核酸降解步骤在本专利技术方法中的到步骤(iv)为止(包括步骤(iv)在内)的任何(一个或多个)时间点进行。优选地，该方法的纯化步骤(iv)包括缓冲液交换步骤。优选地，该方法的纯化步骤(vi)用超滤进行。优选地，超滤包括切向流过滤。优选地，超滤包括中空纤维超滤。优选地，该方法的步骤(v)中的过滤除菌用最大孔径大小为约0.22μm的除菌过滤器进行。优选地，缓冲液交换包括以制剂缓冲液交换前面的步骤所用的缓冲液。优选地，制剂缓冲液是含有糖类的pH缓冲的盐溶液。优选地，缓冲液是基于TRIS的缓冲液。在一个实施方案中，在进行过滤除菌之前先稀释载体颗粒浓度。优选地，反转录病毒载体是慢病毒载体。更优选地，慢病毒载本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种生产反转录病毒载体制剂的方法，所述方法包括过滤除菌步骤，其中所述过滤除菌步骤不是该生产方法中的最终步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/0736852008年6月18日1.一种生产反转录病毒载体制剂的方法，所述方法包括过滤除菌步骤，其中所述过滤除菌步骤不是该生产方法中的最终步骤，其中所述反转录病毒载体衍自EIAV，且所述反转录病毒载体在过滤除菌之前的浓度小于或等于4.6x1011个RNA基因组拷贝/ml反转录病毒载体制品，并且其中所述过滤除菌使所得的制剂不含污染物，使得所述制剂适用于临床应用。


2.权利要求1的方法，其中所述过滤除菌步骤在浓缩步骤之前进行。


3.权利要求1或2的方法，所述方法包括过滤除菌步骤，其中所述过滤除菌步骤不是该生产方法中的最终步骤，其中所述过滤除菌步骤在浓缩步骤之前进行，且其中所述浓缩步骤是该方法中的最后步骤，且所述过滤除菌步骤是该方法中的倒数第二个步骤。


4.权利要求2的方法，其中所述浓缩步骤用超滤来进行。


5.权利要求4的方法，其中所述超滤包括切向流过滤。


6.权利要求4或5的方法，其中所述超滤包括中空纤维超滤。


7.权利要求1或2的方法，其中所述过滤除菌步骤用最大孔径大小最多为0.22μm的除菌过滤器进行。


8.权利要求1或2的方法，其中将包含反转录病毒载体的制品先稀释再进行过滤除菌步骤。


9.一种用于生产反转录病毒载体制剂的方法，该方法按时间顺序包括以下步骤(i)至(vi)：
(i)培养产生反转录病毒载体的细胞；
(ii)收获含有反转录病毒载体的上清液；
(iii)任选澄清上清液；
(iv)纯化反转录病毒载体以得到反转录病毒载体制品；
(v)对反转录病毒载体制品进行过滤除菌，其中所述过滤除菌使所得的制剂不含污染物，使得所述制剂适用于临床应用；和
(vi)浓缩反转录病毒载体制品以生产出最终的批量产品，
其中所述反转录病毒载体衍自EIAV，并且所述反转录病毒载体在过滤除菌之前的浓度小于或等于4.6x1011个RNA基因组拷贝/ml反转录病毒载体制品。


10.权利要求9的方法，其中步骤(iv)用选自色谱法、超滤/渗滤或离心的方法或方法组合来进行。


11.权利要求10的方法，其中所述色谱方法选自离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱和反相色谱、固定化金属离子亲和色谱。


12.权利要求10的方法，其中所述离心方法选自区带离心、等密度离心和粒化离心。


13.权利要求10的方法，其中所述超滤/渗滤方法选自切向流渗滤、搅拌池渗滤和透析。


14.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·特鲁兰，
申请(专利权)人：牛津生物医学英国有限公司，
类型：发明
国别省市：GB