用于制备(R)-网状番荔枝碱及其前体的组合物和方法技术

可用于制造化合物(R)‑网状番荔枝碱及其合成前体的方法。还提供可用于合成(R)‑网状番荔枝碱和合成前体的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本专利合作条约申请要求来自2013年12月4日提交的美国临时专利申请号61/911,759和2014年9月15日提交的美国临时专利申请号62/050,399的根据35USC§119(e)的权益，这两个专利都通过引用以其全文结合在此。披露领域在此披露的组合物和方法涉及次级代谢物和用于制造这些次级代谢物的方法。更具体地说，本披露涉及(R)-网状番荔枝碱及其某些前体以及用于制造(R)-网状番荔枝碱和此类前体的方法和组合物。披露背景以下段落通过背景的方式提供给本披露。然而，它们并不是承认在此所讨论的任何内容是现有技术或是本领域技术人员常识的一部分。生命体的生物化学途径通常被分类为初级代谢的一部分或次级代谢的一部分。为活细胞初级代谢的一部分的途径涉及用于能量产生的分解代谢或涉及用于细胞的结构单元(building block)产生的合成代谢。另一方面，次级代谢物由不具有任何明显的合成代谢或分解代谢功能的活细胞产生。然而很久以前就已经认识到，许多次级代谢物可用于许多方面，包括例如作为治疗剂或天然忌避剂。次级代谢物(R)-网状番荔枝碱由罂粟(罂粟(Papaversomniferum))和植物家族罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科以及桑科的其他成员产生，并且可被用作一种用于产生药物活性化合物(包括吗啡和可待因)的源材料。已知的是，植物中的(R)-网状番荔枝碱是由(S)-网状番荔枝碱产生的。然而还不清楚是哪些基因和多肽涉及催化一个或多个转化反应。目前可从天然来源(诸如罂粟)收获(R)-网状番荔枝碱。可替代地可以合成制备(R)-网状番荔枝碱。然而现有的用于制造(R)-网状番荔枝碱的方法受(R)-网状番荔枝碱产率低的困扰和/或是昂贵的。不存在由(S)-网状番荔枝碱生物合成制备(R)-网状番荔枝碱的方法。因此在本领域中存在对于合成(R)-网状番荔枝碱的改进方法的需要。披露概述以下段落意在向读者介绍随后的更详细说明并且不限定或限制本披露所要求保护的主题。本披露涉及次级代谢物(R)-网状番荔枝碱及其某些前体，以及涉及制备(R)-网状番荔枝碱及其某些前体的方法。因此，本披露在至少一个方面中提供一种制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的方法的至少一个实施例，该方法包括：(a)提供一种苄基异喹啉衍生物；(b)使该苄基异喹啉衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异喹啉衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的条件下将该苄基异喹啉衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。本披露进一步在至少一个方面中提供一种制备(R)-网状番荔枝碱或其前体的方法的至少一个实施例，该方法包括：(a)提供一种苄基异喹啉衍生物；(b)使该苄基异喹啉衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异喹啉衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的条件下将该苄基异喹啉衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体；其中该苄基异喹啉衍生物具有化学式(I)：其中R1、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基基团或甲氧基基团；并且其中R5表示氢原子或甲基基团；并且其中该(R)-网状番荔枝碱前体具有化学式(II)：其中R1、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基基团或甲氧基基团；并且其中R5表示氢原子或甲基基团，其条件是化学式(II)将(R)-网状番荔枝碱除外。在优选实施例中，在该苄基异喹啉衍生物中，R1是甲氧基基团；R2是羟基基团；R3是羟基基团；R4是甲氧基基团并且R5是甲基基团，从而提供化学式：也称为(S)-网状番荔枝碱。在另外的优选实施例中，该酶混合物包含一种第一多肽，该第一多肽能够将该苄基异喹啉衍生物氧化以形成一种具有化学式(IV)的氧化苄基异喹啉衍生物：其中R1、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基或甲氧基基团；并且其中R5表示氢原子或甲基基团；以及一种第二多肽，该第二多肽能够将该氧化苄基异喹啉衍生物(IV)还原以形成具有化学式(II)的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体：其中R1、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基基团或甲氧基基团；并且其中R5表示氢原子或甲基基团，其条件是化学式(II)将(R)-网状番荔枝碱除外。在另外的优选实施例中，该酶混合物包含一种能够将(S)-网状番荔枝碱氧化以形成1,2-脱氢网状番荔枝碱的第一多肽和一种能够将1,2-脱氢网状番荔枝碱还原以形成(R)-网状番荔枝碱的第二多肽。在另外的优选实施例中，能够将该苄基异喹啉衍生物氧化以形成该氧化苄基异喹啉衍生物的该第一多肽是一种细胞色素P450，并且能够将该氧化苄基异喹啉衍生物还原以形成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的该第二多肽是一种醛-酮还原酶(AKR)。根据本披露，这些方法可以在体外或体内进行，包括但不限于在植物、植物细胞培养物、微生物以及无细胞系统中进行。在此进一步提供一种用于制备选自由CYP450和AKR或其混合物组成的组的酶的方法，该方法包括：(a)提供一种嵌合核酸序列，该嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的以下各项：(i)编码选自由CYP450和AKR组成的组的一种或多种多肽的一种或多种核酸序列；以及(ii)能够控制在宿主细胞中的表达的一种或多种核酸序列；(b)将该嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主细胞生长以产生选自由CYP450和AKR组成的组的该多肽；并且(c)从该宿主细胞中回收选自由CYP450和AKR组成的组的多肽。在此进一步提供一种用于制备具有化学式(II)的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的方法，该方法包括：(a)提供一种嵌合核酸序列，该嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的以下各项：(i)一种编码CYP450多肽的第一核酸序列；(ii)一种编码AKR多肽的第二核酸序列；以及(iii)能够控制在宿主细胞中的表达的一种或多种核酸序列；(b)将该嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主细胞生长以产生CYP450和AKR，并且产生具有化学式(II)的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体；并且(c)回收具有化学式(II)的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。在优选实施例中，该第一核酸序列和该第二核酸序列被可操作地连接以便产生一种包含CYP450和AKR的融合多肽。在此进一步提供一种用于制备具有化学式(II)的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的方法，该方法包括：(a)提供一种第一嵌合核酸序列，该第一嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的一种编码CYP450多肽的第一核酸序列和一种控制该第一核酸序列在细胞中的表达的第一核酸序列；(b)提供一种第二嵌合核酸序列，该第二嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的一种编码AKR多肽的第二核酸序列和一种控制该第二核酸序列在细胞中的表达的第二核酸序列；(c)将该第一嵌合核酸序列和该第二嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主细胞生长以产生CYP450和AKR，并且产生具有化学式(II)的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体；并且(d)回收具有化学式(II)的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。本披露进一步提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备(R)‑网状番荔枝碱或(R)‑网状番荔枝碱前体的方法，该方法包括：(a)提供一种苄基异喹啉衍生物；(b)使该苄基异喹啉衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异喹啉衍生物转化成(R)‑网状番荔枝碱或(R)‑网状番荔枝碱前体的条件下将该苄基异喹啉衍生物转化成(R)‑网状番荔枝碱或(R)‑网状番荔枝碱前体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.04 US 61/911,759;2014.09.15 US 62/050,3991.一种制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的方法，该方法包括：(a)提供一种苄基异喹啉衍生物；(b)使该苄基异喹啉衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异喹啉衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的条件下将该苄基异喹啉衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。2.一种制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的方法，该方法包括：(a)提供一种苄基异喹啉衍生物；(b)使该苄基异喹啉衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异喹啉衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的条件下将该苄基异喹啉衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体；其中该苄基异喹啉衍生物具有化学式：其中R1、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基基团或甲氧基基团；并且其中R5表示氢原子或甲基基团；并且其中该(R)-网状番荔枝碱前体具有化学式：其中R1、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基基团或甲氧基基团；并且其中R5表示氢原子或甲基基团，其条件是(R)-网状番荔枝碱被排除在该化学式之外。3.根据权利要求2所述的方法，其中该苄基异喹啉衍生物选自下组，该组由以下各项组成：(S)-N-甲基乌药碱、(S)-3’-羟基-N-甲基乌药碱和(S)-网状番荔枝碱，并且其中该(R)-网状番荔枝碱前体选自(R)-N-甲基乌药碱、(R)-3’-羟基-N-甲基乌药碱。4.根据权利要求2所述的方法，其中该酶混合物包含一种能够将该苄基异喹啉前体氧化以形成氧化苄基异喹啉前体的第一多肽和一种能够将该氧化苄基异喹啉前体还原以形成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的第二多肽，其中该氧化苄基异喹啉前体具有化学式：其中R1、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基或甲氧基基团；并且其中R5表示氢原子或甲基基团。5.根据权利要求4所述的方法，其中能够将该苄基异喹啉前体氧化成该氧化苄基异喹啉前体的该第一多肽是一种细胞色素P450，并且能够将该苄基异喹啉前体还原以形成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的该第二多肽是一种醛-酮还原酶。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中该第一多肽是一种选自下组的多肽，该组由以下各项组成：NO:219至SEQ.ID NO:321；SEQ.ID NO:325；以及SEQ.ID NO:338，并且其中该第二多肽是一种选自下组的多肽，该组由以下各项组成：SEQ.ID NO:59至SEQ.ID NO:115；SEQ.ID NO:327；SEQ.ID NO:329；SEQ.ID NO:330以及SEQ.ID NO:340。7.根据权利要求4或5所述的方法，其中该第一多肽和该第二多肽是一种融合多肽。8.根据权利要求7所述的方法，其中该融合多肽是在SEQ.ID NO:323中列出的该多肽。9.根据权利要求1-8所述的方法，其中该方法在体内或体外进行。10.根据权利要求5-9所述的方法，其中该细胞色素P450和该醛-酮还原酶可获得自以下植物家族的组中的一个成员，该组由以下各项组成：罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科以及桑科。11.根据权利要求10所述的方法，其中植物家族的该成员选自以下植物物种的组，该组由以下各项组成：罂粟、大红罂粟以及虞美人。12.一种用于制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的方法，该方法包括：(a)提供一种嵌合核酸序列，该嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的以下各项：(i)一种编码CYP450多肽的第一核酸序列；(ii)一种编码AKR多肽的第二核酸序列；以及(iii)能够控制在宿主细胞中的表达的一种或多种核酸序列；(b)将该嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主细胞生长以产生CYP450和AKR，并且产生(R)-网状番荔枝碱或该(R)-网状番荔枝碱前体；并且(c)回收(R)-网状番荔枝碱或该(R)-网状番荔枝碱前体。13.根据权利要求12所述的方法，其中该(R)-网状番荔枝碱前体具有化学式：其中R1、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基基团或甲氧基基团；并且其中R5表示氢原子或甲基基团，其条件是(R)-网状番荔枝碱被排除在该化学式之外。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中该第一核酸序列和该第二核酸序列被可操作地连接以便产生一种包含CYP450和AKR的融合多肽。15.根据权利要求12-14所述的方法，其中编码CYP450的该核酸序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ.ID NO:116至SEQ.ID NO:218；SEQ.ID NO:324；以及SEQ.ID NO:337，并且其中编码AKR的该核酸序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ.ID NO:1至SEQ.ID NO:58；SEQ.ID NO:326；SEQ.ID NO:328；以及SEQ.ID NO:339。16.根据权利要求12-14所述的方法，其中该CYP450和该AKR可获得自以下植物家族的组中的一个成员，该组由以下各项组成：罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科以及桑科。17.根据权利要求16所述的方法，其中植物家族的该成员选自以下植物物种的组，该组由以下各项组成：罂粟、大红罂粟以及虞美人。18.一种用于制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的方法，该方法包括：(a)提供一种第一嵌合核酸序列，该第一嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的一种编码CYP450多肽的第一核酸序列和一种控制该第一核酸序列在细胞中的表达的第一核酸序列；(b)提供一种第二嵌合核酸序列，该第二嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的一种编码AKR多肽的第二核酸序列和一种控制该第二核酸序列在细胞中的表达的第二核酸序列；(c)将该第一嵌合核酸序列和该第二嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主细胞生长以产生CYP450和AKR，并且产生(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体；并且(d)回收(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。19.根据权利要求18所述的方法，其中该(R)-网状番荔枝碱前体具有化学式：其中R1、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基基团或甲氧基基团；并且其中R5表示氢原子或甲基基团，其条件是(R)-网状番荔枝碱被排除在该化学式之外。20.根据权利要求19所述的方法，其中编码CYP450的该核酸序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ.ID NO:116至SEQ.ID NO:218；SEQ.ID NO:324以及SEQ.ID NO:337，并且其中编码AKR的该核酸序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ.ID NO:1至SEQ.ID NO:58；SEQ.ID NO:326；SEQ.ID NO:328；以及SEQ.ID NO:339。21.根据权利要求18或19所述的方法，其中该CYP450和该AKR可获得自以下植物家族的组中的一个成员，该组由以下各项组成：罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科以及桑科。22.根据权利要求21所述的方法，其中植物家族的该成员选自以下植物物种的组，该组由以下各项组成：罂粟、大红罂粟以及虞美人。23.一种用于制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的组合物，该组合物包含一种酶混合物，该酶混合物包含一种能够将一种苄基异喹啉衍生物氧化以形成一种氧化苄基异喹啉衍生物的第一多肽和一种能够将该氧化苄基异喹啉衍生物还原以形成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的第二多肽；其中该苄基异喹啉类生物碱衍生物具有化学式其中R1、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基基团或甲氧基基团；并且其中R5表示氢原子或甲基基团；并且其中该(R)-网状番荔枝碱前体具有化学式：其中R1、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基基团或甲氧基基团；并且其中R5表示氢原子或甲基基团，其条件是(R)-网状番荔枝碱被排除在该化学式之外。24.根据权利要求23所述的组合物，其中该第一多肽是一种细胞色素P450并且该第二多肽是一种醛-酮还原酶。25.根据权利要求23或24所述的组合物，其中该第一多肽是一种选自下组的多肽，该组由以下各项组成：NO:219至SEQ.ID NO:321；SEQ.ID NO:325；以及SEQ.ID NO:338，并且其中该第二多肽是一种选自下组的多肽，该组由以下各项组成：SEQ.ID NO:59至SEQ.ID NO:115；SEQ.ID NO:327；SEQ.ID NO:329；SEQ.ID NO:330以及SEQ.ID.NO:340。26.根据权利要求23-25所述的组合物，其中该第一多肽和该第二多肽是一种融合多肽。27.根据权利要求23至24或权利要求26所述的组合物，其中该细胞色素P450和该醛-酮还原酶可获得自以下植物家族的组中的一个成员，该组由以下各项组成：罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科以及桑科。28.根据权利要求27所述的组合物，其中植物家族的该成员选自以下植物物种的组，该组由以下各项组成：罂粟、大红罂粟以及虞美人。29.一种重组表达载体，包含作为可操作地连接部件的以下各项：(i)一种能够控制在宿主细胞中的表达的核酸序列；以及(ii)一种编码CYP450的核酸序列，其中该表达载体适合于在宿主细胞中的表达。30.根据权利要求29所述的重组表达载体，其中编码CYP450的该核酸序列是一种选自下组的核酸序列，该组由以下各项组成：SEQ.ID NO:116至SEQ.ID NO:218；SEQ.ID NO:324；以及SEQ.ID NO:337。31.根据权利要求29所述的重组表达载体，其中该CYP450可获得自罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科以及桑科组成的植物家族的一个成员。32.根据权利要求31所述的方法，其中植物家族的该成员选自由罂粟、大红罂粟以及虞美人组成的植物物种。33.一种重组表达载体，包含作为可操作地连接部件的以下各项：(i)一种能够控制在宿主细胞中的表达的核酸序列；以及(ii)一种编码AKR的核酸序列，其中该表达载体适合于在宿主细胞中的表达。34.根据权利要求34所述的重组表达载体，其中编码AKR的该核酸序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ.ID NO:1至SEQ.ID NO:58；SEQ.ID NO:326；SEQ.ID NO:328；以及SEQ.ID NO:339。35.根据权利要求33所述的重组表达载体，其中该AKR可获得自罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科以及桑科组成的植物家族的一个成员。36.根据权利要求35所述的方法，其中植物家族的该成员选自由罂粟、大红罂粟以及虞美人组成的植物物种。37.一种重组表达载体，包含作为可操作地连接部件的以下各项：(i)一种能够控制在宿主细胞中的表达的核酸序列；以及(ii)一种编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·詹姆斯·法基尼，斯科特·卡梅伦·法罗，纪劳姆·亚瑟·韦尔奇·博杜安，
申请(专利权)人：埃皮梅伦公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA