用于基因转移的病毒包膜载体制造技术

本发明专利技术通过将外源基因导入灭活病毒的包膜，经由冻融处理或与表面活性剂混合，来制备基因转移载体。本发明专利技术还提供含有该基因转移载体的基因治疗药用组合物，含有该基因转移载体的试剂盒，以及应用该基因转移载体的基因转移方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于体外和体内基因转移的安全、高效载体。具体地，本专利技术涉及通过使用病毒或灭活的病毒，尤其灭活的HVJ(仙台病毒)所制备的基因转移载体。而且，本专利技术所述基因转移载体还可用于基因治疗和大规模(high throughput)筛查。
技术介绍
现已开发了多种旨在用于基因治疗的病毒性和非病毒性(合成的)基因转移方法(Mulligan，科学，260，926-932(1993)和Ledley，人类基因治疗，第6卷，1129-1144(1995))。一般而言，病毒方法比非病毒方法能更有效地将基因转移至细胞中。但病毒载体由于同时引入了亲代病毒的基本基因元件，以及病毒基因的渗漏表达，免疫原性，和对宿主基因组结构的修饰，使得它存在安全性方面的考虑。非病毒载体一般具有较少的细胞毒活性和较小的免疫原性。但大多数非病毒方法的基因转移效率(尤其在体内)低于某些病毒载体。因此，病毒载体和非病毒载体都既有限制又有优点。因此必须开发体内应用的高效、低毒性基因转移载体，以便弥补其中一类载体系统的限制又具有另一类系统的优点。另一方面，HVJ具有较高免疫原性，且已知可诱导CTL，特别是当产生大量NP蛋白时(Cole，G.A.等，免疫学杂志158，4301-4309(1997))。也有人担心宿主的蛋白质合成可能被抑制。HVJ还有一个问题，当使病毒融合蛋白经离心或柱操作而纯化以便在脂质膜上重建时，所产生的颗粒可能由于重建而失去病毒的其它蛋白(主要是M蛋白)，从而使要求融合活性的F1与HN蛋白间的比率不能维持在与野生型病毒相同的水平，导致较低融合活性。此外，由于融合蛋白在重建时插入脂质膜的方向不必与在野生型中一样，故可提呈某些未知抗原。另有人报道了一种通过添加新的分子而实施重建的方法(Uchida，T.等，细胞生物学杂志80，10-20，1979)。但该方法存在失去原有病毒功能的高度危险，因为合成颗粒的膜组分本质上不同于天然病毒颗粒的膜组分。涉及将基因或蛋白包入脂质体并将其与灭活的HVJ融合而产生融合颗粒(如在传统HVJ-脂质体中一样)的方法已能将非侵袭性或非毒性基因转移至培养的细胞或体内组织中。该项技术在世界各地频繁用于动物试验中(Dzau，V.J.等，美国国家科学院学报，93，11421-11425(1996)和Kaneda，Y.等，今日分子医学，5，298-303(1999))。但已有人发现该项技术的缺陷例如，由于须制备两种不同载体，即病毒和脂质体，该方法可能比较复杂；由于与脂质体融合而致使平均直径比病毒颗粒大1.3倍的那些颗粒，它们的融合活性为病毒的10％或更低。此外，就某些组织而言，基于传统HVJ的载体可能不能获得任何基因转移，或如果可以，效率也极低。这表明，根据传统方法可用于基因治疗的组织很有限。有需要开发一种用于人类基因治疗的病毒性载体，其可安全、高效、并简单地制备，还能将基因转移至广泛多种体内组织中。因此，本专利技术的一个目标是开发一种安全、高效、且简单的基于病毒的基因转移载体，其可应用于广泛多种培养细胞或体内组织，它克服了传统重建型HVJ载体方法或HVJ-脂质体方法的缺点。专利技术公开在本专利技术的一个方面中，提供一种安全、高效的利用灭活病毒的基因转移载体。灭活病毒(其中病毒的基因组已被灭活)不能复制病毒蛋白，因此比较安全并具有低细胞毒性和低抗原性。通过将基因包入病毒包膜载体这种利用灭活病毒的基因转移载体，可制备一种安全、高效、且简单的用于培养细胞或体内组织的基因转移载体。在本专利技术另一方面中，提供一种能将基因转移至很多种体内组织中的病毒包膜载体。在一个实施方案中，所用病毒是HVJ。可利用本专利技术之病毒包膜载体获得体内基因转移的组织的实例有，但不限于肝脏、骨胳肌、子宫、脑、眼、颈动脉、皮肤、血管、肺、心脏、肾脏、脾脏、癌组织、神经、B淋巴细胞、以及呼吸道组织。在本专利技术另一方面中，提供简单实现(realizing)向悬浮细胞的基因转移的方法。利用本专利技术病毒包膜载体向悬浮细胞实施基因转移的优选方法实例包括，在有硫酸鱼精蛋白的条件下使悬浮细胞与病毒包膜载体混合，并使混合物离心的基因转移方法。在本专利技术另一方面中，通过利用本专利技术的能在短时间内包容大量基因的基因转移载体实现向培养细胞和体内组织中高效且快速的基因转移。因此，在本专利技术另一方面中，利用本专利技术基因转移载体建立对基因组的高流通量、快速质量分析系统。在本专利技术另一方面中，基因转移载体可长期以冷冻状态贮存于-20℃。例如，可将该基因转移载体以冷冻状态密封、贮存、并运输。本专利技术另一方面提供一种基因转移载体，其对优选70％或更多的细胞，更优选80％或更多的细胞，还更优选对90％或更多的细胞，最优选对95％或更多的细胞具有体外基因转移活性。本专利技术一个特定方面提供一种基因转移载体，当灭活病毒制备成功的2个月后，产生病毒包膜载体作为基因转移载体时，可维持基因转移活性的60％或更多，优选70％或更多，更优选80％或更多，最优选90％或更多。本专利技术另一方面提供一种基因转移载体，当体内局部给与时，其对优选30％或更多的组织中细胞，更优选40％或更多的组织中细胞，还更优选50％或更多的组织中细胞，最优选60％或更多的组织中细胞具有基因转移活性。本专利技术的一方面提供一种含有灭活病毒的包膜的基因转移载体。本专利技术的一方面中，用于制备基因转移载体的病毒可以是野生型病毒或重组型病毒。本专利技术又一方面中，所用病毒属于逆转录病毒科(Retroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、以及嗜肝DNA病毒科(Hepdnaviridae)。本专利技术一个具体方面中，所用病毒为HVJ。在本专利技术另一方面中，用Hasan，M.K.等(普通病毒学杂志，78，2813-2820(1997))或Yonemitsu，Y.等(自然生物技术学(Nature Biotechnology)18，970-973(2000))所述重组仙台病毒制备基因转移载体。本专利技术另一方面提供能向动物体内组织实施基因转移的基因转移载体。在制备本专利技术基因转移载体的方法中，不必灭活病毒。因此，本专利技术一个方面中，可在不进行灭活病毒的步骤的前提下，利用含以下步骤的方法制备基因转移载体1)使病毒与外源基因混合，和2)冻融该混合物，或进一步使该混合物与一种表面活性剂混合。本专利技术另一方面提供用于基因转移的灭活型病毒包膜载体的制备方法，该方法包括以下步骤灭活病毒，使该灭活的病毒与外源基因混合，和冻融该混合物。本专利技术又一方面提供用于基因转移的灭活型病毒包膜载体的制备方法，该方法包括以下步骤灭活病毒，和使该灭活的病毒与外源基因在有表面活性剂存在的情况下混合。在本专利技术另一方面中，所用表面活性剂选自辛基葡糖苷、Triton-X100、CHAPS和NP-40。本专利技术一个具体方面提供制备灭活型病毒包膜载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有病毒包膜的基因转移载体。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：金田安史，
申请(专利权)人：安增子摩祺株式会社，金田安史，
类型：发明
国别省市：JP[日本]