分泌表达型心肌基因治疗质粒载体制造技术

一种分泌表达型心脏基因治疗质粒载体，其特征在于在分泌型真核表达载体上有心肌细胞特异的启动子ＣＭＶ－ＭＬＣ－２ｖ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因治疗质粒及其构建方法，具体地说，本专利技术涉及一种分泌表达型心肌基因治疗质粒载体及其构建方法。
技术介绍
心肌基因治疗是一种治疗遗传性和先天性心脏病的新型方法。将外源基因转入心肌细胞内，通过基因表达，从而达到纠正或增强心肌细胞功能的目的。根据基因治疗所用载体不同可将基因转移法分为四类病毒载体法、非病毒性生物载体法、非生物性载体法和非载体法。质粒DNA注射属于非载体法，质粒DNA直接肌肉注射，简单易行，且注入的DNA往往不能整合入染色体中而游离于染色体之外，不会引起突变和肿瘤的发生，因此是一种较为安全的基因治疗手段。目前进行的心肌基因治疗主要包括心肌缺血区血管发生、逆转心肌细胞肥厚和降低心肌细胞凋亡等方面。由于一般的真核表达质粒没有心肌细胞特异性启动子，不能控制在心肌细胞中特异地表达目的基因，因而大大降低了基因治疗的特异性和有效性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决心脏基因治疗的靶向性问题，提供一种心脏基因治疗靶向性较好的载体，本专利技术的另一个目的是提供一种用于心脏基因治疗的可分泌表达目的基因的基因治疗载体及其构建方法。本专利技术的目的通过下述方法得以实现。质粒pSec-Tag2A，pSec-Tag2B，pSec-Tag2C是美国lnvitrogen公司的产品，货号为V900-20，http//www.invitrogen.com上有登载序列和结构。本专利技术的质粒的构建采用了人心肌肌球蛋白轻链(MLC-2V)启动子，取代原质粒pSec-Tag2A或pSec-Tag2B或pSec-Tag2C的CMV启动子，使之具有在心肌细胞内表达的特异性。进一步说明是，先制备MLC-2V片段及CMV增强子片段序列，用PCR扩增连接法制备CMV增强子-MLC-2V连接片段，使其5′、3′端分别引入Mlu I和Nhe I识别序列，根据pSec-Tag2A或2B或2C多克隆位点上游CMV增强子和启动子两侧单一的MluI和NheI识别位点，以定向克隆法将CMV增强子-MLC-2V片段替换CMV增强子和启动子。构建了PSec-mlc-Tag2A，序列为SEQ ID NO1PSec-mlc-Tag2B，序列为SEQ ID NO2PSec-mlc-Tag2C，序列为SEQ ID NO3本专利技术的载体包含以下四个特点1、包含鼠Ig轻链V-J2-C信号肽的编码序列，V-J2-C信号肽可引导目的基因的表达产物分泌到细胞膜外，并与之分离，使得目的基因的表达产物更好地发挥生物学功能。2、该载体的多克隆位点上游采用人心肌肌球蛋白轻链(MLC-2V)启动子，MLC-2V启动子是心肌细胞的特异性表达的启动子，因此可使载体携带的目的基因特异性地在心肌细胞内表达。3、A，B，C载体分别包含3个移码读框，可以满足表达不同读框的目的基因的要求。4、能在表达目的蛋白的C-末端添加6His和C-myc表位标签，便于检测目的基因的表达效果。本专利技术的质粒的碱基序列在人心肌肌球蛋白轻链2启动子区与多克隆位点间(即209～1041位碱基)不能变动，其余部分的碱基序列可以在1％范围内变异，即99％以上相同，而不影响本专利技术的效果。本专利技术的质粒载体的构建也可以不采用上述商业质粒，而采用直接改建其它真核表达质粒的多克隆位点上游的增强子和启动子序列的方式获得。本专利技术的质粒可以制成注射剂。本专利技术的质粒可用于基因治疗心脏疾病。并可与其它心血管疾病药物联合应用，包括制成复方制剂。附图说明图1为本专利技术的pSec-MLC-Tag2A的结构图谱pSec-MLC-Tag2A质粒构件(5230bp)1、人心肌肌球蛋白轻链2启动子区209-9662、鼠Ig轻链V-J2-C信号肽977-10393、多克隆位点1042-11534、C-myc表位1154-1186 5、多组氨酸区1199-12166、BGH多腺苷酸序列1238-14527、f1起始区1515-19288、SV40启动子和起始区1996-23179、Zeocin抗性基因2400-277410、SV40多腺苷酸序列2904-303311、Col E1起始区3417-409012、氨苄抗性基因4235-5095图2为本专利技术的pSec-MLC-Tag2B的结构图谱pSec-MLC-Tag2B质粒构件(5234bp)1、人心肌肌球蛋白轻链2启动子区209-9662、鼠Ig轻链V-J2-C信号肽977-10393、多克隆位点1042-11574、C-myc表位1158-11905、多组氨酸区1203-12206、BGH多腺苷酸序列1242-14567、f1起始区1519-19328、SV40启动子和起始区2000-23219、Zeocin抗性基因2404-277810、SV40多腺苷酸序列2908-303711、Col E1起始区3421-409412、氨苄抗性基因4239-5099 图3为本专利技术的pSec-MLC-Tag2C的结构图谱pSec-MLC-Tag2C质粒构件(5238bp)1、人心肌肌球蛋白轻链2启动子区209-9662、鼠Ig轻链V-J2-C信号肽977-10393、多克隆位点1042-11614、C-myc表位1162-11945、多组氨酸区1207-12246、BGH多腺苷酸序列1246-14607、f1起始区1523-19368、SV40启动子和起始区2004-23259、Zeocin抗性基因2408-278210、SV40多腺苷酸序列2912-304111、Col E1起始区3425-409812、氨苄抗性基因4243-510具体实施方式实施例1PSec-MLC-Tag2A质粒的构建根据已知的人MLC-2V启动子序列，设计合成PCR引物上游引物，5′-AATGGGAGTTTGTTTTGGACCCAGAGCACAGAG-3′，-下游引物，5′-TAATAGCTAGCGGCCGGCCCCTGCTGT-3′(Nhe I)，以人基因组DNA为模板，扩增获得MLC-2V片段(250 bp)。序列SEQ ID NO4如下GACCCAGAGCACAGAGCATCGTTCCCAGGCCAGGCCCCAGCCACTGTCTCTTTAACCTTGAAGGCATTTTTGGGTCTCAC GTGTCCACCCAGGCGGGTGTCGGACTTTGAACGGCTCTTACTTCAGAAGAACGGCATGGGGTGGGGGGGCTTAGGTGGCCTCTGCCTCACCTACAACTGCCAAAAGCGGTCATGGGGTTATTTTTAACCCCAGGGAAGAGGTATTTATTGTTCCACAGCAGGGGCCGGCC根据pSec-Tag2A载体的CMV增强子序列(CMV enhancer)，设计合成PCR引物上游引物，5′-GCCAGATATACGCGTT-3′(Mlu I)，下游引物，5′-CTCTGTGCTCTGGGTCCAAAACAAACTCCCATT-3′，以pSec-Tag2A载体为模板，扩增获得CMV enhancer片段(497bp)。序列SEQ ID NO5如下GCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余细勇，单志新，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：