抗细胞膜糖蛋白KD－43的单克隆抗体GDK－1及其****碘化物DGDK－1和应用制造技术

本发明专利技术提供一种抗细胞膜糖蛋白ＫＤ－４３的单克隆抗体ＧＤＫ－１，编码其可变区蛋白的核苷酸序列为序列表中的〈２１０〉１和〈２１０〉２；还提供了一种抗细胞膜糖蛋白ＫＤ－４３的［１３１－］↑碘化单克隆抗体ＤＧＤＫ－１及其在制备专一治疗肝癌的药物中的应用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及单克隆抗体(简称单抗)领域，尤其是关于抗细胞膜糖蛋白KD-43的单克隆抗体GDK-1，及其131-碘化单克隆抗体DGDK-1和其在制备治疗肝癌的药物中的应用。
技术介绍
放射治疗对某些局限性的肿瘤病灶非常有效，但并非对所有的恶性肿瘤均敏感，此外，对转移病灶，一般说来放射治疗是无效的。而今天的化学药物治疗至多还只是一种或可缓解病情的辅助手段。即使放射治疗和化学药物治疗今后在疗效上会有进步，也很难说它们是一类理想的治疗方法，因为这类方法无选择地作用于恶性肿瘤细胞和正常细胞，所导致的副作用往往为患者所不能忍受。德国人Paul Ehrlich在20世纪初最先提出抗肿瘤导向药物的设想，所谓肿瘤的导向治疗(Targeted Therapy)，乃是一种能选择性杀死恶性肿瘤细胞而对正常细胞无毒害的治疗肿瘤的新概念。由于没有理想的导向载体，长时间以来，导向药物的研究一直进展得十分缓慢。1975年，Koehler和Milstein用杂交瘤技术制备了世界上第一个鼠源单克隆抗体，为生物技术打开了一个全新的领域，随着生物技术的发展，单克隆抗体技术也有了很大的发展，各种整分子的、小分子的、鸡尾酒的、双功能的以至抗独特性的单克隆抗体均陆续问世；单克隆抗体技术的出现和发展激励了不少人再去探索导向治疗的可行性，重新去寻找上世纪初的旧梦。经过十多年的探索和努力，作为生物反应调节治疗(Biological ResponseModulizer)的一种重要的内容，以单克隆抗体为载体的导向抗肿瘤药物已成为一百多年来肿瘤免疫治疗领域中最引人注目的进展之一。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗细胞膜糖蛋白KD-43的单克隆抗体GDK-1，其特征在于编码其可变区蛋白的核苷酸序列为序列表中的<210>1和<210>2。其为鼠源的或人鼠嵌合的。其为整分子IgG或IgG的Fab片段。还提供了一种抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-磺化单克隆抗体DGDK-1，编码其可变区蛋白的核苷酸序列为序列表中的<210>1和<210>2。其为鼠源的或人鼠嵌合的。其为整分子IgG或IgG的Fab片段。本专利技术还提供了该131-碘化单克隆抗体DGDK-1在制备治疗肝癌的药物中的应用。该肝癌为巨块型肝癌或弥漫型肝癌。其放射剂量范围在20-100mCi之间。该131-碘化单克隆抗体DGDK-1为液体，使用方法为与生理盐水配制后两周内1-5次注射。本专利技术产品能用于降低肝癌患者的甲胎蛋白水平，其有效率高达75％左右；能用于追踪治疗肝癌转移病灶，因而可以用于治疗晚期有转移的肝癌患者；除巨块型外，还可用于治疗弥漫型肝癌；能有效地降低原发性肝细胞肝癌手术后的复发率，延长他们的生存期，对临床II期肝癌患者，二步切除后的10年生存率可达35％以上；能有效地改善患者的食欲、提高患者的体力，有效率达85％以上。附图说明图1DGDK-1能在人体内直接杀死癌细胞的组织化学显色照片。图1A注射DGDK-1前，组织化学显色表明癌细胞依然存活。图1B注射DGDK-120天后，组织化学显色表明癌细胞发生玻璃状凝集，说明癌细胞已经被杀死。图2纵隔转移灶SPECT影象。受试者(No.20)为一例肝癌切除后纵隔转移患者，注射DGDK-1后第6天纵隔转移灶放射性浓集。表明DGDK-1在人体内能追踪转移灶。图2A纵隔转移灶矢状面的SPECT影象。图2B纵隔转移灶冠状面的SPECT影象。图2C纵隔转移灶横断面的SPECT影象。图3纵隔病灶组织化学显色照片。受试者(No.20)，肝癌切除后纵隔转移，注射DGDK-1一个月后切除，组织化学显色表明单克隆抗体依然结合在病灶组织上，提示注射后至少30天内，在体内的单克隆抗体还能保持其免疫活性。图3A纵隔病灶放大20倍的组织化学显色照片。图3B纵隔病灶放大40倍的组织化学显色照片。图4DGDK-1全身显象(受试者No.8)。注射后24小时及48小时的ECT全身影象，DGDK-1在肝肿瘤上浓集(箭头所示)。图5注射DGDK-1后的连续动态显象图5A连续观察12天，病灶仍显影。(受试者)图5B连续观察9天，病灶仍显影。(受试者)图5C连续观察13天，病灶仍显影。(受试者)图6DGDK-1的临床药代动力学研究中，受试者(No.8)各脏器的时间-放射性曲线。图6-1膀胱时间-放射性曲线。图6-2脑时间-放射性曲线。图6-3受试者(No.8)肾脏时间-放射性曲线。图6-4受试者(No.8)肝脏时间-放射性曲线。图6-5受试者(No.8)肺时间-放射性曲线。图6-6受试者(No.8)脾脏时间-放射性曲线。图6-7受试者(No.8)甲状腺时间-放射性曲线。图7静脉注射DGDK-1后的血液廓清曲线。具体实施例方式实施例1、抗细胞膜糖蛋白KD-43的单克隆抗体(GDK-1)的制备方法1).抗原和免疫细胞膜糖蛋白KD-43是一种分布在人癌细胞膜表面、特别是在人肝癌细胞膜表面的一种糖蛋白，其分子量为43kD，其特定的变异的决定簇，可能为人癌细胞，特别是人肝癌细胞所特有。我们以含有细胞膜糖蛋白KD-43的癌细胞膜为抗原，免疫BALB/C小鼠，共免疫3-5次，临用前3-5天加强1次，3-5天后取脾作融合。2).细胞融合将从小鼠体内摘除的脾脏切碎，离心分离脾细胞，悬浮在RPMI1640培养基中并洗净。以同样方法在含有10％胎牛血清的RPMI1640中培养小鼠骨髓瘤细胞株NS-1，在密度达106/ml时将细胞用上述RPMI1640培养基洗净。然后将骨髓瘤细胞和上述脾细胞以1∶5-10的比例放入离心管中并混合，以在聚乙二醇4000作用下按常规方法(Clin.Exp.Immunol.，42，458-462，1980)进行细胞融合。然后，将所得到的融合细胞分散于含HAT的RPMI1640培养基的96孔平板中，并在37℃和5％CO2条件下在保温箱中培养之。以HAT培养液换液若干次，继以HT培养液换液，直至克隆形成，详见Clin.Exp.Immunol.，42，458-462，1980。3).筛选以含有细胞膜糖蛋白KD-43的癌细胞膜为靶标，筛选出目的克隆。其方法为a.离心并回收靶细胞膜，将细胞膜沉淀物悬浮在100μl杂交瘤培养上清中并在37℃下反应1小时。b.用PBS清洗1次后，加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体并保温1小时。c.用PBS清洗1次后，用荧光显微镜观察分析之。d.然后使用有限稀释法，按常规程序反复克隆(至少6次)，每次的克隆效率应低于35％，所得到的稳定分泌单克隆抗体的融合细胞即为目的克隆。e.将目的克隆细胞培养于生物反应器中，收集反应器中的培养上清液，50％饱和硫酸铵沉淀保存。f.或将目的克隆细胞培养于Balb/c小鼠的腹腔中，收集小鼠的腹水，50％饱和硫酸铵沉淀保存。4).分离和纯化a.按常规高压液相色谱法(如阳离子交换柱)，将所获得的目的克隆的50％饱和硫酸铵沉淀物纯化；b.或按常规低压柱层析法(如Protein G柱)，将所获得的目的克隆的50％饱和硫酸铵沉淀物纯化。5).专一性分析间接免疫荧光法组织名称N1N2P1P2GDK-1大脑- - + + -小脑- - + 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗细胞膜糖蛋白ＫＤ－４３的单克隆抗体ＧＤＫ－１，其特征在于编码其可变区蛋白的核苷酸序列为序列表中的〈２１０〉１和〈２１０〉２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢弘，王根凤，姚鑫，陈瑞铭，来文，谢雍，王放，陈中健，褚云芳，李隽吉，朱海颖，戴慧敏，强家模，
申请(专利权)人：上海中科生龙达生物技术集团有限公司，神农氏医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]