新的单体胰岛素，药物组合物及其制法制造技术

本发明专利技术提供了新的胰岛素Ｂ链、含该Ｂ链的单体胰岛素、含所述单体胰岛素的药物组合物，及其制法和用途。本发明专利技术的胰岛素类似物Ｂ＃－［２７］Ｋ去三肽胰岛素（Ｂ＃－［２７］Ｋ－ＤＴｒＩ），用酶促半合成法得到高纯度的样品，并证明其具有单体胰岛素（生理ｐＨ值、较高浓度时不聚合）的性质，整体生物活力为正常胰岛素的８０％。利用酵母表达系统分泌表达单体胰岛素前体，酶切得Ｂ＃－［２７］Ｋ－ＤＴｒＩ可省却传统工艺中的酶促转肽步骤，从而提高终产率，适合于工业化生产。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学和药物学领域。更具体地，本专利技术涉及新的胰岛素B链、含该B链的单体胰岛素、含所述单体胰岛素的药物组合物，及其制法和用途。
技术介绍
糖尿病发病率逐年上升，并能引发心血管疾病致死，是当今威胁人类健康的主要疾病之一。高血糖是引发各种糖尿病并发症的原因，而严格控制每天24小时的血糖浓度在正常范围是防止、延缓糖尿病后期并发症的最关键因素。胰岛素从20世纪20年代用于治疗糖尿病以来，一直是无可替代的特效药。但是，正常人体内胰岛素的分泌是受血糖浓度调控的，一般是在进餐后30-60分钟血胰岛素浓度达到峰值，4-5小时后恢复到基础浓度，这样能够保证血糖浓度不因进餐而有大的波动。常规胰岛素制剂在临床给药中不能模仿生理胰岛素分泌的时相性，很难有效的控制饭后的血糖升高，还有给患者带来低血糖的危险。这是因为在中性溶液中，浓度高于100nM时胰岛素以二聚体、六聚体的形式存在，而其必须解离成单体后结合专一受体发挥生理功能。这种分子间的聚合提高了胰岛素的稳定性，利于贮存和调节活性，确保能够精细、灵活地调控血糖，但给胰岛素的吸收造成很大的障碍。胰岛素制剂(0.6mM)以六聚体形式存在，注射后经过5-10万倍的稀释由六聚体转为二聚体在转为单体胰岛素方能被毛细血管吸收进入血液循环，在肌肉或皮下这种高倍的稀释是一个慢而长的过程，2-4小时只有50％的胰岛素被吸收。皮下注射胰岛素制剂后，90-120分钟后血胰岛素达到比较低的峰值，之后又不能快速降低。(Home，P.D.，et al.，Metabolism，1981，30439；Blundall，T.，et al.，Adv.Protein Chem.，1972，26279；Drejer，K.，Diabetes/Metabolism Reviews，1992，8259；Insulin research group，Academia Sinica，Sci.Sin.，1974，17779；Brange，J.Stability of insulin，1994；Brange，J.et al.，Advanced Drug Delivery Reviews，1999，35307-335)。在中性溶液中自聚合性质降低的胰岛素称为单体胰岛素，在给药处无须经过高倍稀释即可被迅速吸收，且缩短了给药后药物作用的时程，故而获得可用于临床的单体速效胰岛素是开发新一代治疗糖尿病药物的主要目标之一。EliLilly公司开发的单体胰岛素Lyspro于1996年分别在欧洲和美国用于临床，取得很好效果。皮下注射Lyspro后15分钟起效，1个小时血胰岛素浓度达到峰值，2-4小时后恢复到，饭后15分钟给Lyspro和饭前20分钟给常规胰岛素的效果相当。目前Novo公司研发的另一种单体胰岛素Aspart正处于临床研究中。(Howey，D.C.，et al.，Diabetes，1994，43396-402；Torlone，E.et al.，Diabetologia，1994，37713-720；Rami，B.et al.，Eur.J.Pediatr.1999，156838-840；Vajo，Z.et al.Pharmacological reviews.2000，521-9)。中国专利ZL98 110912.8公开了在啤酒酵母中分泌表达单体胰岛素前体(MIP)，通过酶促转肽获得单体胰岛素的方法。该单体胰岛素的B链C端去五肽胰岛素DPI，或者B链C端去四肽胰岛素DTI)(Cui，D.F.，et al.，JPept Res，2001.57188-92)。然而，该工艺因以下主要缺点而难以大规模生产(1)需要化学合成小肽，如GFFY(But)Obut；(2)胰蛋白酶酶促转肽时，得率在80％以内；(3)酶促转肽后中间体需要经过强酸，如三氟乙酸(TFA)处理以脱去保护基；(4)工艺流程复杂，存在化学副反应。因此，本领域迫切需要开发新的制法简便、适合大规模生产的单体胰岛素。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种制法简便、适合大规模生产的单体胰岛素。本专利技术的另一目的是提供含有该单体胰岛素的药物组合物。本专利技术的再一目的是提供所述单体胰岛素和药物组合物的制法和用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种胰岛素B链，具有以下氨基酸序列FVNQH LCGSH LVEAL YLVCG ERX23X24X25X26Y27(SEQID NO1) 其中，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；Y27是Lys，或Arg。在一优选例中，Y27是Lys。在另一优选例中，X23X24X25X26是GFFY。在本专利技术的第二方面，提供了一种胰岛素，它上述的B链。在一优选例种，所述胰岛素是单体胰岛素。在另一优选例中所述的胰岛素的结构如下 其中，X23、X24、X25、X26、Y27如上定义。在本专利技术的第三方面，提供了一种药物组合物，含有本专利技术所述的胰岛素和药学上可接受的载体。在本专利技术的第四方面，提供了一种单体胰岛素表达前体，它从氨基端至羧基端分别含有本专利技术上述的胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链，其中连接肽为Ala-Ala-Lys。在本专利技术的第五方面，提供了一种分离的DNA，该DNA编码上述的胰岛素B链、或单体胰岛素表达前体。还提供了含有所述DNA的载体，以及含有所述DNA或所述载体的宿主细胞。在本专利技术的第六方面，提供了一种制备胰岛素的方法，包括步骤(a)在表达条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码单体胰岛素表达前体的DNA，从而表达出所述的单体胰岛素表达前体；所述的前体从氨基端至羧基端分别含有胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链，其中胰岛素B链具有以下氨基酸序列FVNQH LCGSH LVEAL YLVCG ERX23X24X25X26Y27式中，X23、X24、X25、X26和Y如上定义；(b)分离出所述的单体胰岛素表达前体； (c)用胰蛋白酶酶切割所述的单体胰岛素表达前体；(d)分离出单体胰岛素。附图说明图1，DOI的DEAE-Sephadex A25分离图，流动相为pH7.3，50mmol/L Tris缓冲液，含有40％异丙醇，盐梯度为(0.05-0.2mol/L NaCl)；主峰为DOI。横坐标为流出体积，纵坐标为A280nm。图2，Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut的薄层层析，左，粗品；右，纯化后产物。3/7系统展开剂为3份A(吡啶4V，醋酸1V，水1.5V)、7份B(醋酸丁酯10V，异丙醇4V)，氯气-淀粉-KI显色。图3，Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut的HPLC分析，C8柱，(Beckman，4.6×250mm)，流动相B为含0.1％TFA的70％乙腈，流动相A为含0.1％TFA的水，梯度(0-100％B/0-50min)，流速为1ml/min。横坐标为流出时间，纵坐标为A280nm。图4，pH8.3聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶浓度为15％，考马斯亮兰染色。从左到右分别为DOI，酶促反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰岛素Ｂ链，其特征在于，具有以下氨基酸序列：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＸ↓［２３］Ｘ↓［２４］Ｘ↓［２５］Ｘ↓［２６］Ｙ↓［２７］其中，Ｘ↓［２３］、Ｘ↓［２４］、Ｘ↓［２５］和Ｘ↓［２６］各自独立，分别是Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｐｒｏ，Ｍｅｔ，Ｈｉｓ，Ｖａｌ或不存在，且Ｘ↓［２３］、Ｘ↓［２４］、Ｘ↓［２５］和Ｘ↓［２６］中至多有一个不存在；Ｙ↓［２７］是Ｌｙｓ，或Ａｒｇ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张友尚，丁金国，崔大敷，石嘉豪，
申请(专利权)人：上海中科生龙达生物技术集团有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]