本发明专利技术提供了一种能够影响血小板功能的寡肽Ｒ－Ｇ－Ｓ（ｐ）－Ｌ－Ｐ或其修饰物／衍生物，以及该寡肽Ｒ－Ｇ－Ｓ（ｐ）－Ｌ－Ｐ或其修饰物／衍生物在预防和／或治疗动脉血栓性疾病和／或其它与血小板ＧＰＩｂａｌｐｈａ与ＡＢＰ相互作用相关疾病方面的应用。以寡肽Ｒ－Ｇ－Ｓ（ｐ）－Ｌ－Ｐ或其修饰物／衍生物处理后的血小板，可有效抑制血小板的粘附功能，包括抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能，而不影响血小板聚集功能，包括ＡＤＰ诱导血小板聚集功能等，因而能抑制血栓形成并能基本维持血小板功能状态的完整性。可直接用于临床抗血栓药物的研发。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的合成的可穿膜寡肽，其氨基酸序列及其抑制血小板功能的能力。 本专利技术属于分子生物学和血液病学。
技术介绍
血栓栓塞性疾病，如心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞等，是当前严重危害 人类健康，导致死亡率较高的原因之一，预防和治疗血栓形成，已成为当前临床上重要的防 治方法。血小板在血栓形成过程中起着十分重要的作用。在正常血液循环过程中，血小板 处于静止状态，而在发生血管壁损伤处，特别在血管中高切应力环境下，血小板就会通过其 表面膜糖蛋白(GP)Ib-IX复合物中的Ib受体与血浆von Willebrand因子(vWF)结合并 粘附于受损血管处暴露的内皮下组织，进而引起粘附的血小板被内皮下组织或局部形成的 凝血酶所激活，发生释放反应和花生四烯酸代谢。由前者分泌释放的ADP或由后者形成的 血栓烷(TX)A2均可引起血小板聚集。血小板聚集是由血小板GPIIb/IIIa受体所调解，激 活的GPIIb/IIIa受体通过纤维蛋白原分子在相邻的血小板之间形成横桥，构成血小板聚 集的骨架，最终导至血栓形成。血小板释放产物TXA2等还可进一步与血浆蛋白作用促进血 栓的形成。可见，血小板膜糖蛋白GPIb与vWF的结合是血小板血栓形成的起始关键过程。 而GPIba的膜外部分含有vWF的结合位点，最新研究表明，细胞内信号分子14-3-3蛋白与 GPIb a C末端的结合，是调控GPIb-IX与vWF结合并进而导致血小板活化以及形成血小板血 栓的关健。 有效抑制各阶段血小板的作用，是预防或治疗血栓形成性疾病的一个基本思路和 有效途径。而目前国内外临床上常用抗血小板药物如阿斯匹林、噻氯匹啶等都是抑制血小 板与vWF结合黏附后功能的某一环节，这些药物，在发挥抗栓作用的同时，由于此前粘附而 活化的血小板释放出的生物活性物质，同样会对出、凝血的生理平衡产生消极影响，而均存 在着较大的缺点如引起血小板减少，出血以及使用后栓塞的再形成。而以调节或抑制vWF 与血小板GPIba的结合为靶标，创制一种可调节或抑制血小板的始动活化途径，从而调节 或抑制血小板聚集的新型抗血小板药物，必将会对血栓性疾病的治疗和预防产生意想不到 的效果。 现有研究表明，在调控血小板GPIb-IX与vWF结合过程中，细胞内信号分子14-3-3 蛋白与GPIb的结合起关键作用。在GPIb中，已知有3个14-3-3蛋白结合位点，分别为 GPIb a 609位点，GPIb a 587-590位点和GPIb P 166位点。这些位点对GPIb与vWF结合的 作用各不相同，但这些位点都是以磷酸化Ser为中心的结构域。在此领域的多年研究之中， 本室发现在GPIba 559位点为14-3-3蛋白的又一结合位点，故此本专利技术在现有研究基础 上，本室研究创建了新的可穿膜寡肽。
技术实现思路
本专利技术目的就是研究构建新的寡肽序列，并合成可穿膜寡肽，对其抑制血小板粘 附、聚集的功能进行研究验证，最终创制一种具有自主知识产权，可有效抑制血栓形成，并 对出、凝血功能不产生消极影响的新型药物。 技术方案本专利技术应用抗体制备技术制备血小板GPIba 559Ser磷酸化抗体， ELESA检测所制备抗体与血小板结合情况，从而设计合成新的可穿膜寡肽，瑞斯托霉素和 ADP诱导血小板聚集试验对可穿膜寡肽功能进行研究。结果表明可穿膜寡肽可降低瑞斯托 霉素诱导的血小板聚集，而对ADP诱导的血小板聚集没有影响。 本专利技术的优点在于 1.可穿膜寡肽只对血小板GPIba与vWF的结合功能有抑制作用，即对血栓形成的 起始有抑制作用，而对其他凝血功能无影响。 2.不同浓度的可穿膜寡肽，对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集作用的抑制程度不 同，即对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集作用具有调节功能，具有良好的药物开发潜力。 3.可穿膜寡肽分子量较小，对人体免疫原性低，可直接用于人体。 4.可穿膜寡肽分子结构稳定，易于合成与纯化，可大量生产，具有广阔的产业化前旦 豕。 而现有国内外临床上使用的抗血小板药物都是抑制血小板黏附后功能的一个环 节，其防栓作用相对较弱，且对出、凝血生理平衡产生消极影响，并受适用范围、生产工艺、 知识产权等等诸多因素的限制。附图说明 图1显示制备抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗体的免疫原即所合成的小分子寡 肽的氨基酸序列。 图2显示所制备的抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗体的特异性及效价。 图3显示所制备的抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗体检测血小板GPIb a ELISA结果。 图4显示本专利技术构建的可穿膜寡肽的氨基酸序列。 图5显示可穿膜寡肽降低瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能。A为阴性对照，B为可穿膜寡肽(100 i！ M)抑制瑞斯托霉素诱导血小板聚集功能，C， D为对照寡肽。 图6显示不同浓度可穿膜寡肽对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能的影响。A为阴性对照，B， C， D， E分别为不同浓度可穿膜寡肽(25 ii M， 50 ii M， 100 y M， 200 y M)抑制瑞斯托霉素诱导血小板聚集功能。 图7显示在添加GP II b/IIIa拮抗剂RGDS的条件下可穿膜寡肽对瑞斯托霉素诱 导的血小板聚集功能的影响。A为阴性对照，B为阴性对照添加RGDS后瑞斯托霉素诱导的 血小板聚集功能，C为可穿膜寡肽(100i!M)抑制瑞斯托霉素诱导血小板聚集功能，D为可穿 膜寡肽(lOOi!M)添加RGDS后抑制瑞斯托霉素诱导血小板聚集功能。 图8显示可穿膜寡肽对ADP诱导的血小板聚集功能无影响。A为阴性对照，B为可 穿膜寡肽，C，D为对照寡肽。 图9显示可穿膜寡肽对流动腔装置中血小板在vWF表面黏附功能的影响。具体实施例方式以下借助非限制性实施例举例详细描述本专利技术。 实施例1 :抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗体的制备，鉴定及对血小板GPIb a的 检测。 1.材料与试剂合成寡肽，新西兰大白兔，福氏佐剂、MBS、KLH均购自Sigma公司。 羊抗兔IgG-HRP购自中山公司。ECL反应试剂购自普利莱公司，其余均为国产分析纯试剂。 2.方法 (1)血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗体制备试验合成寡肽通过MBS与KLH交联， 作为免疫抗原，与福氏佐剂充分混匀乳化后，进行背部多点皮下免疫，三次免疫后，收集分 离免疫血清。合成寡肽序列如图l所示。 (2)血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗体效价及特异性检测ELISA试验合成寡肽 以10ug/ml浓度包被ELISA检测板，每孔100 yl， 4。C孵育过夜后，每孔200 1%明胶封 闭，37t:孵育l小时，PBS洗涤3次。每孔加入100iU按四倍梯度稀释的抗血清(对照为免疫前兔血清)，37t:孵育i小时，洗涤3次后每孔加入ioOiU i : ioooo稀释的羊抗兔IgG-HRP， 37t:孵育1小时，洗涤3次后进行OPD显色，室温避光孵育10min， 50 yl 3M硫酸 中止反应后，测定样品在A492的吸光值。由图2可见，所制备抗体特异识别抗原，且抗体效 价较高。 (3)血小板GPIb a 559Ser磷酸化ELISA检测试验:同(2)方法，将血小板GPIb a以1 P g/ml的浓度包被ELISA检测板，检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可穿膜寡肽，其特征在于该寡肽的氨基酸序列为ＲＧＳ（ｐ）ＬＰ，其中（ｐ）是指丝氨酸（Ｓ）磷酸化。
【技术特征摘要】
一种可穿膜寡肽，其特征在于该寡肽的氨基酸序列为RGS(p)LP，其中(p)是指丝氨酸(S)磷酸化。2. —种如权利要求1所述的寡肽的修饰物，其特征在于，所述寡肽的修饰物是对寡肽 RGS(p)LP的N端进行修饰后得到的产物，所述修饰包括化学修饰和具有膜穿透作用的多肽 修饰。3. 如权利要求2所述的寡肽的修饰物，其特征在于，所述化学修饰为十四烷酰化修饰 和十六烷酰化修饰。4. 如权利要求3所述的寡肽的修饰物，其特征在于，所述化学修饰为十四烷酰化修饰。5. 如权利要求2所述的寡肽的修饰物，其特征在于，所述多肽修饰为HIV-TAT修饰。6. —种如权利要求l所述的寡肽的衍生物。7. 如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴克胜，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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