本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种具有与血小板膜糖蛋白的高特异性、高亲合力结合并具有抗血栓生物活性的嵌合型单克隆抗体及其应用；一种抗人血小板膜糖蛋白Ibα人鼠嵌合型单克隆抗体，其特征在于，包括鼠源重链可变区、鼠源轻链可变区；所述鼠源重链可变区的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，所述鼠源轻链可变区的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。由于抗体分子的免疫反应性主要由恒定区产生，因此含有人源性恒定区的嵌合抗体就不易在人体内产生抗鼠的免疫反应；本发明专利技术所述抗血小板GP?Ibα单克隆抗体可以与人以及猕猴血小板膜糖蛋白Ibα(GP?Ibα)高特异性、高亲合力结合，具有抗血栓作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有与血小板膜糖蛋白的高特异性、高亲合力结合并具有抗血栓生物活性的嵌合型单克隆抗体及其应用。
技术介绍
流行病学研究显示，随着生活条件的改善及人口的老龄化，近几十年来血栓栓塞性疾病所引起或并发的病变，是当前严重危害人类健康的疾病。血小板在血栓的形成中起着关键性作用，血小板聚集是血栓形成的必要过程。正常生理情况下，血栓可以防止血细胞渗漏到血管外，然而在特定的疾病条件下，血栓可以抑制或者完全阻止血液流动从而导致细胞性坏死。发生在动脉粥样硬化斑块处的血小板聚集以及随后的血栓形成，在心绞痛、急性心肌梗塞、溶栓以及血管成形术后的血栓再形成等疾病中起着重要的作用，对心梗患者进行经皮导管血管成形术(PTCA)及溶栓治疗是挽救患者生命的重要手段。而这些治疗方法的一个重要并发症就是血小板在血管成形术造成的血管内皮损伤部位发生粘附和聚集，再次形成血栓，从而进一步加重对心脏的损伤。我们已经知道血小板通过GPrt α受体粘附于受损血管壁，是血小板血栓形成的开始步骤，因此封闭GP Iba受体的药物可以从初始阶段就阻止血栓形成，能减少甚至防止溶栓药物治疗后的血栓再形成，并且加快血栓溶解。这类药物同样在对其他血管阻塞以及血栓栓塞性疾病的治疗中有应用前景。近年来，对血小板在血栓形成过程中分子机制研究促进了分子靶向药物的发展， 其中以针对血小板糖蛋白(GP) nb a/IIIa的单克隆抗体阿昔单抗(abciximab，Reopro)为代表，临床应用已取得了良好的抗血栓治疗效果。然而，由于阿昔单抗也存在引起严重出血的潜在危险，所以在一定程度上阻碍了这类药物的临床应用。为了克服抗血栓药物的缺陷，以抗血小板粘附为代表的寻找新的抗栓治疗手段在国际上正方兴未艾，人们试图通过抑制胶原-血管性血友病因子(VWF)-血小板GPrta轴阻断血小板与胶原的起始粘附，即在早期阶段阻止血小板的黏附和活化，以达到阻止血栓形成的目的，并能减少出血的危险性。因此，研制和开发阻断血小板GPrt α与受损血管壁之间相互作用的单抗，不仅能从血栓形成的早期阶段阻断血栓的形成，而且希望能够利用该单抗探究血小板如何通过 GPIba与血管性血友病因子Al区结合后，发生构型改变，从而调节止血功能，从而进一步阐明动脉血栓形成和发展的机理，为预防和早期治疗血栓性疾病开辟新的领域，从而开发成新型的抗动脉血栓新药。制备针对血小板膜糖蛋白GPrta的特异性单克隆抗体，通过阻断血管性血友病因子Al区与血小板GPrta之间相互作用，是一种抑制血栓形成的有效方法。由于鼠源抗体在人体内可能会诱导产生人抗鼠免疫反应，这种反应可能减弱或者破坏它的治疗效果， 甚至可以在病人中引起变态反应或超敏反应，因此限制了在病人中的应用。另外，在治疗血栓栓塞性疾病时，常常需要反复给药，这样更增加了这些免疫反应的发生概率。杨剑峰博士发表的学位论文《抗血小板膜糖蛋白Λ α单克隆抗体的人源化及基于膜糖蛋白结构的活性小分子化合物研究》公开了一种抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体，但是该抗体只识别人血小板膜糖蛋白Λα，与比格犬，猕猴等常用模式动物血小板无交叉反应，限制了针对该抗体的各种成药性评价研究。此外，鼠源抗体在人体内可能会诱导产生人抗鼠免疫反应，这种反应可能减弱或者破坏它的治疗效果，甚至可以在病人中引起变态反应或超敏反应，因此限制了在病人中的应用。另外，在治疗血栓栓塞性疾病时，常常需要持续用药，这样更增加了这些免疫反应的发生概率。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供一种抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型单克隆抗体及其应用。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是一种抗人血小板膜糖蛋白Λα 人鼠嵌合型单克隆抗体，包括鼠源重链可变区、鼠源轻链可变区；所述鼠源重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述鼠源轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。上述技术方案中，所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型单克隆抗体还包括人源重链恒定区、人源轻链恒定区；其中，所述人源重链恒定区选自IgG( Yheavy chains) ,IgM(U)^IgA(Q), IgE ( O、IgD(S)五种同种型中的一种；所述人源轻链恒定区选自kappa或lambda中的一种；上述技术方案中，所述嵌合型单克隆抗体分子中的抗原结合区来自小鼠抗体，嵌合型单克隆抗体的恒定区部分来源于人免疫球蛋白。上述技术方案中，由于重链的不同亚型(如IgG的重链亚型)跟不同的效应功能有关，因此要嵌合抗体产生所需的效应功能，就要选择相应的重链恒定区，因此，所述人源重链恒定区优选为IgGl(Y 1 heavy chains)、IgG3 ( γ 3)、IgG4 ( γ 4)三种亚类中的一种； 更优选为IgGl的重链恒定区。上述技术方案中，所述人源轻链恒定区优选为kappa的轻链恒定区。上述技术方案中，SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列具体为EVQLQQSGPELVKLGASVKI SCKASGYSFTAYLMNWVKQSHGKSLEWIGRITPYNGDTFYNQKFKDKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDSAVYFCG RSRYGNLYYYAMDYffGQGTSVTVSS ；SEQ ID No. 2 所示的氨基酸序列具体为DIVMSQSPSSQAVSIGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQ KNYLAWFQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEI KR。上述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型单克隆抗体的制备方法包括以下步骤首先获得嵌合抗体的重链和轻链可变区基因，具体做法为利用特异性引物，分别扩增出鼠源的抗血小板膜糖蛋白Λα的特异性的可变区序列(或者部分恒定区序列)。其次通过基因克隆的方法分别将扩增获得的重链及轻链可变区基因片段与相应的人抗体的恒定区序列，正确连接，经测序确认后，成功构建嵌合抗体的重链及轻链表达载体。最后，将含有重链和轻链基因的表达载体共转染到能够高表达目的基因产物的表达细胞，经多轮特异性筛选后，获得特异性表达目标嵌合抗体的高表达细胞株，收集细胞培养上清，经特异性纯化后获得目标嵌合抗体。上述技术方案中，抗膜糖蛋白Λα的轻链和重链可变区的基因来源于表达特异性表达膜糖蛋白Λα的鼠源性单克隆抗体杂交瘤细胞株。例如，抗GPrta的嵌合抗体的可变区基因可以从表达针对GPrt α抗体的杂交瘤细胞中得到。本专利技术所用的杂交瘤细胞株是用活化的人血小板免疫小鼠，将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，亚克隆杂交瘤细胞，筛选表达抗血小板或GPrt α抗体的单克隆，获得杂交瘤细胞株。上述技术方案中，恒定区基因可以用成熟的克隆技术从人抗体产生细胞中获得。 另外，由于两种轻链基因以及五种重链基因已经被成功克隆，因此从这些克隆中就可以很容易得到人源的恒定区。通过设计嵌合重链基因的截短形式可以制备嵌合抗体的抗原结合片段如F(ab，)2和Fab。如编码F(ab，)2重链部分的嵌合基因包含有CHl及重链铰链区的DNA序列。另外，这种片段可以用酶切嵌合抗体的方法得到。例如，用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶酶切可以分别得到Fab或F本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：阮长耿，赵益明，季顺东，杨剑锋，江淼，沈飞，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：
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