本发明专利技术的抗病毒工程多肽由基因工程技术将可特异结合病毒包膜抗原或受体的多肽与可形成离子通道大肠菌素或其通道结构域组成，它具有两种分子结构：ａ．大肠菌素或其通道结构域的羧基端与可特异结合病毒包膜抗原或受体的多肽的氨基端连，ｂ．大肠菌素或其通道结构域的氨基端与可特异结合病毒包膜抗原或受体的多肽的羧基端连接，分子量为５，０００－１００，０００，利用基因工程技术将大肠菌素或其通道结构域与能够特异结合不同种病毒的包膜抗原或受体的各种多肽分别连接之后，就可以组成对抗不同病毒的多种抗病毒工程多肽。它通过破坏病毒体包膜来杀伤病毒体和预防病毒感染。它具有高度特异性，属窄谱抗病毒药物。由于病毒体包膜的脂质双分子膜结构不易突变，因而病毒将难以依靠经典的突变来逃避该多肽的杀病毒效应。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人工组合的抗病毒工程多肽及其制备方法，通过制备由不同的细菌毒素和可与病毒包膜抗原或受体特异结合的多肽，比如scFv结构域组合成的工程多肽(Engineered peptide)来达到抗病毒目的。目前抗病毒治疗多从以下几方面着手1，抑制病毒核酸，2，抑制病毒蛋白酶3，利用免疫因子杀伤，比如干扰素，4，利用病毒疫苗免疫等。然而，在实际应用中，病毒利用其突变特点往往很快就能让上述治疗手段失效。比如数年前投入使用的抗乙肝病毒药物Laminvudine，刚开始使用时有效率几达90％，然而仅仅经过数年的临床应用，由于乙肝病毒的基因迅速发生突变，有效率从当初的90％左右降至只有10％左右。因此必需寻找其他更为有效的抗病毒途经。基于上述现状，专利专利技术人认为应该选择病毒不易发生突变的结构作为药物作用的靶点来杀伤病毒，这样才能从根本上避开现有抗病毒治疗手段容易被病毒突变所破坏的致命弱点。本专利技术针对现有抗病毒治疗手段容易被病毒突变所破坏的致命弱点，提供一种特异而有效的抗病毒药物及其制备方法。本专利技术的技术方案是将可形成离子通道的大肠菌素(colicin El，Ia，Ib，A，B，N)或其通道结构域和可与靶病毒包膜抗原或受体特异结合的多肽组合成工程多肽。在该工程多肽里，可与靶病毒包膜抗原或受体特异结合的多肽作为诱导物诱导大肠菌素通道结构域到达靶病毒包膜附近，然后大肠菌素结构域在包膜上形成离子通道，破坏包膜的完整性，病毒核糖核酸外泄或暴露从而杀伤病毒体。该专利技术制备方法的独创之处在于利用基因工程技术，将可特异结合病毒包膜抗原或受体的多肽基因插入到装载在工程质粒里的大肠菌素基因选定的位点上来组合该抗病毒工程多肽。另一独创之处在于利用0.1-0.3M NaCl梯度洗脱自离子交换柱收获制备的抗病毒工程多肽。制备方法中的其余流程采用专利专利技术人已发展成熟的技术流程(Qiu et al，Site-specific biotinylation of colicin Ia，a probe for proteinconformation in the membrane.J Biol Chem 2697483-7488(1994)，Qiu et al，Majortransmembrane movement associated with colicin Ia channel gatingJ.Gen.Physiology.107313-328(1996))。因此该制备方法的可行性及可靠性极高。该制备方法中技术路线的关键在于利用基因工程技术制备成人工组合抗菌工程多肽的质粒，然后将突变好的质粒转染到不含质粒的工程菌里制备多肽和利用0.1-0.3MNaCl梯度洗脱自离子交换柱纯化工程多肽。可特异结合病毒包膜抗原或受体的多肽与大肠菌素或其通道结构域的组合方式可以有两种，将多肽或结合在大肠菌素或其通道结构域的氨基端，或结合在大肠菌素或其通道结构域的羧基端，这样便可以形成四种工程多肽。此外，可以通过改变工程多肽肽链的长度及氨基酸残基组成来增强其抗病毒活性或减少可能出现的副作用。由于这样的组成或改变将会增加或减少该工程多肽的氨基酸残基数量，因此其分子量将会在5,000-100,000范围内变动。每一种包膜病毒都有自己独特的包膜抗原或受体，因此只要采用可与其特异结合的多肽与可形成离子通道的大肠菌素或其通道结构域连接，就可以组合成一种特异的、对抗该病毒的抗病毒工程多肽。也就是说，本专利技术的一大优点是有可能通过更换多种可与不同病毒包膜抗原或受体结合的多肽来和大肠菌素或其通道结构域组成对抗任何一种包膜病毒的抗病毒药物。本专利技术的另一大优点是制备的抗病毒工程多肽可直接在病毒体包膜上形成离子通道以破坏包膜的完整性，这种杀病毒方式与使用核酸类似物取代病毒DNA前体的核苷类药物、抑制病毒蛋白酶药物、干扰素及中药等抑制病毒药物、免疫抑制剂及基因工程核酸疫苗等传统方法相比较，其好处在于它采用的是自然界经过亿万年自然选择优选出来的一种最简单有效杀灭生物体的机制，这种机制具有很高的靶向性，这样就保证了该抗病毒工程多肽只杀死选定的病毒体而不伤害宿主细胞，从而最大限度的减小了上述传统抗病毒药物对宿主的毒副作用。具体实施例方式实施例1本实施例是将Gene Bank AF427148登录的抗HBV PreS1 scFv基因连接到大肠菌素Ia通道结构域的氨基端上，制备成人工组合的抗HBV工程多肽的质粒，将突变好的质粒转染到不含质粒的工程菌里，将菌大量繁殖(4L FB培基，225rpm，37℃；6h)，离心沉淀菌体(4℃，6000g，20min)，取4℃、50mM硼酸缓冲液+2mM EDTA+2mM DTT50-80ml悬浮菌体，超声破碎(4℃，40W，1-2min)，高速离心破碎菌体(4℃，70000g，1.5h)，取上清加入硫酸链霉素沉淀DAN，4℃、50mM硼酸缓冲液+2mM EDTA+2mM DTT 2L透析过夜后，上样于CM离子交换柱，0.1-0.3M NaCl+50mM硼酸缓冲液梯度洗脱后便得到了纯化率达90％以上的抗HBV工程多肽，分子量4万左右，粗制剂蛋白含量约为5-10mg/ml。预实验中，该工程多肽对体外培养的人体细胞和实验动物未表现出毒副作用。在设定的实验动物模型中，该工程多肽应表现出一定的抗HBV能力。权利要求1.一种人工组合的抗病毒工程多肽，其特征在于该多肽由基因工程技术将可特异结合不同种病毒包膜上固有的抗原或受体的多肽或衍生物与可形成离子通道大肠菌素，包括colicin El，Ia，Ib，A，B和N，或其通道结构域，或它们的衍生物人工连接组成，其分子量为5,000-100,000。2.根据权利要求1所述的人工组合的抗病毒工程多肽，其特征在于其分子结构为可形成离子通道大肠菌素或其通道结构域的羧基端与可特异结合病毒包膜抗原或受体的多肽的氨基端连接。3.根据权利要求1所述的人工组合的抗病毒工程多肽，其特征在于其分子结构为可特异结合病毒包膜抗原或受体的多肽的羧基端与可形成离子通道的大肠菌素或其通道结构域的氨基端连接。4.一种人工组合的抗病毒工程多肽的制备方法，其特征在于利用基因工程技术将可特异结合病毒包膜抗原或受体的多肽基因插入到装载在工程质粒里的大肠菌素基因选定的位点上，再将突变好的质粒转染到不含质粒的工程菌里，经大量繁殖菌，超声破碎，高速离心沉淀破碎菌体及沉淀DNA，透析之后由离子交换柱收获制备的抗病毒工程多肽。全文摘要本专利技术的抗病毒工程多肽由基因工程技术将可特异结合病毒包膜抗原或受体的多肽与可形成离子通道大肠菌素或其通道结构域组成，它具有两种分子结构a.大肠菌素或其通道结构域的羧基端与可特异结合病毒包膜抗原或受体的多肽的氨基端连，b.大肠菌素或其通道结构域的氨基端与可特异结合病毒包膜抗原或受体的多肽的羧基端连接，分子量为5,000－100,000，利用基因工程技术将大肠菌素或其通道结构域与能够特异结合不同种病毒的包膜抗原或受体的各种多肽分别连接之后，就可以组成对抗不同病毒的多种抗病毒工程多肽。它通过破坏病毒体包膜来杀伤病毒体和预防病毒感染。它具有高度特异性，属窄谱抗病毒药物。由于病毒体包膜的脂质双分子膜结构不易突变，因而病毒将难以依靠经典的突本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人工组合的抗病毒工程多肽，其特征在于该多肽由基因工程技术将可特异结合不同种病毒包膜上固有的抗原或受体的多肽或衍生物与可形成离子通道大肠菌素，包括ｃｏｌｉｃｉｎ Ｅ１，Ｉａ，Ｉｂ，Ａ，Ｂ和Ｎ，或其通道结构域，或它们的衍生物人工连接组成，其分子量为５，０００－１００，０００。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丘小庆，
申请(专利权)人：成都阳辉生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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