一种新型抗肺炎链球菌多肽及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种新型抗肺炎链球菌多肽及其制备方法，该重组抗肺炎链球菌多肽，其含有可形成离子通道的大肠菌素或其水性孔道结构域，以及肺炎链球菌信号传导多肽。本发明专利技术还公开了编码该重组抗肺炎链球菌多肽的核苷酸序列，以及含有所述核苷酸序列的重组质粒。本发明专利技术的新型抗肺炎链球菌多肽相较于传统抗菌素的优点在于，其不会诱导细菌产生传统的耐药性。细菌较难以通过突变来改变其细胞膜的磷脂双分子层的结构，而本发明专利技术的重组多肽通过直接在靶细菌的胞膜上形成离子通道而达到杀菌目的。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组的抗肺炎链球菌多肽，编码该多肽的核苷酸和氨基酸序列。本专利技术还涉及重组抗肺炎链球菌多肽的制备方法。
技术介绍
细菌感染是人类生命和健康的主要威胁，自磺胺和青霉素问世以来，人类陆续专利技术的抗菌素主要以通过抑制细菌胞壁合成、抑制或干扰细菌的核酸和蛋白质的代谢与合成途径来达到抗菌目的。然而这些抗菌途径容易诱使细菌发生突变而产生抗菌素耐药性。因此人们一直在致力于开发新型的抗菌素。在细菌胞膜上直接形成离子通道而致细菌死亡是比较有前途的抗菌素开发方向之一。自然界中，为数不少的细菌毒素就是以这种机制来杀死细菌的，其模式标本就是大肠杆菌(Escherichia coli)分泌的一种毒素蛋白——大肠菌素(colicin)，1952年Jacob发现其能特异地杀死其它株系的大肠杆菌和相关株系的某些杆菌，如Shigella Sonnei(Jacob et al，)Sur labiosynthese d’une colicine et son mode d’action，Annals of thePasteur Institute.83295-315(1952))。1978年Finkelstern等发现了可形成离子通道的大肠菌素可以在人工脂质双分子膜上形成电压依赖性离子通道，从而在根本上揭示了这一类细菌毒素的抗菌机制(Schein et al，.Colicin K acts by forming voltagedependent channels in phospholipid bilayer membranes.Nature 276159-163(1973))。1996年Qiu和Finkelstein等揭示了大肠菌素Ia在人工脂质双分子膜上形成的离子通道开放和关闭时的跨膜立体结构(Qiu et al.，Major transmembrane movementassociated with colicin Ia channel gating.J.Gen.Physiology.107313-328(1996))，为在分子水平上设计和制备新型的抗菌素奠定了理论基础。近二十年，人们逐渐发现细菌也具有随外界环境变化而分泌的信号传导多肽，制备信号传导多肽的胞膜受体及胞内调节蛋白的基因往往偶联在一起，协调地控制着细菌的生长和分裂，但该方向的研究一直进展缓慢，比如金黄葡萄球菌的信号传导多肽AgrD，一直到1995年才最后搞清楚是一个八肽(Ji et al.，Celldensity control of staphylococcal virulence mediated by an octapeptide pheromone.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9212055-12059(1995))。1999年发现金黄色葡萄球菌对数生长期的早期或中晚期加入人工合成的这种八肽可以刺激或抑制金黄色葡萄球菌的生长(Mayville et al.，Structure activity analysis of synthetic autoinducingthiolactone peptides from staphylococcus aureus responsible for virulence.PNAS，961218-1223(1999))。如上所述，大肠菌素是一种理想的离子通道抗菌素，缺点是只能作用于大肠杆菌等格兰氏阴性杆菌，如果能利用致病菌特有的信号传导肽作为诱导物，将大肠菌素或其水性孔道结构或诱导至特定的细菌膜附近形成离子通道来杀伤该致病菌，应该是一种理想的抗菌素开发方向。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种新型的重组抗菌多肽，其含有大肠菌素和肺炎链球菌信号传导多肽，从而能避免诱发细菌的耐药性，提高杀菌能力。本专利技术的另一目的在于提供编码该重组抗肺炎链球菌多肽的核苷酸序列。本专利技术的再一目的在于提供一重组质粒，其含有编码本专利技术重组抗肺炎链球菌多肽的核苷酸序列。本专利技术的再一目的在于提供一氨基酸序列，其编码本专利技术的重组抗肺炎链球菌多肽。本专利技术的再一目的在于提供含有本专利技术重组抗肺炎链球菌多肽的药物组合物。本专利技术的再一目的在于提供本专利技术抗肺炎链球菌多肽在制备抗菌药物中的应用。本专利技术的再一目的在于提供重组抗肺炎链球菌多肽的制备方法。根据本专利技术的一方面，将编码肺炎链球菌信号传导多肽的基因与大肠菌素基因可操作地连接，从而获得表达重组抗肺炎链球菌多肽的核苷酸序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，采用编码肺炎链球菌的信号传导多肽的基因(SEQ ID NO.1)作为抗菌多肽的信息素基因，其编码如SEQ ID NO2所示的17个氨基酸的肽；大肠菌素可选自能形成离子通道的大肠菌素E1、Ia、Ib、A、B和N或其水性孔道结构域，在本专利技术的一个优选实施例中，将上述肺炎链球菌信号传导多肽基因与大肠菌素Ia(SEQ ID NO.3)的羧基端连接而形成如SEQ ID NO.4的核苷酸序列。该核苷酸序列编码如SEQ ID NO.5的氨基酸序列，该氨基酸序列所编码的多肽即为本专利技术的抗肺炎链球菌多肽Ph-SP。在构建的重组抗肺炎链球菌多肽中，可与靶细菌胞膜受体结合的信号传导多肽作为诱导物诱导大肠菌素通道结构域穿过细菌外膜与膜间隙到达靶细胞膜附近，然后大肠菌素水性孔道结构域在靶细菌胞膜上形成离子通道，使靶细菌胞内内容物泄漏而致靶细菌死亡，从而达到杀菌的目的。根据本专利技术的另一方面，提供如附图说明图1所示的包含本专利技术核苷酸的质粒载体，该质粒载体是将如上所述的编码肺炎链球菌信号传导多肽的核苷酸序列经双链寡聚核苷酸点突变技术插入大肠菌素Ia基因的第626位氨基酸上而形成本专利技术的重组质粒。本专利技术中，构建质粒载体的原始质粒pSELECTTM-1来自于Promega公司，其中装载了大肠菌素Ia和immunity蛋白基因，针对肺炎链球菌信号传导基因设计了二对引物，其序列分别如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO9所示。利用双链寡聚核苷酸点突变技术，经两次突变，按照Strategene公司药箱操作获得重组质粒，再将获得的重组质粒转染入大肠杆菌TG1工程菌而获得宿主细胞。根据本专利技术的再一方面，提供含有本专利技术重组抗肺炎链球菌多肽的药物组合物，可以通过将本专利技术的多肽添加药学上可接受的载体或赋形剂或可选的其它成分而制成适于临床使用的药物组合物。根据本专利技术的又一方面，提供本专利技术抗肺炎链球菌多肽的制备方法，将编码肺炎链球菌信号传导多肽的基因可操作地与大肠菌素基因连接获得编码重组抗肺炎链球菌多肽的基因，将获得的基因导入到表达系统中进行表达，分离表达的多肽而获得本专利技术的抗肺炎链球菌多肽。本专利技术的抗肺炎链球菌多肽相较于传统抗菌素的优点在于，其不会诱导细菌产生传统的耐药性。众所周知，细菌可以通过突变产生β-内酰胺酶、减少摄入、改变药物作用位点等方式来改变其细胞壁结构，改变其蛋白质和核酸的代谢等对传统抗菌素产生耐药性。但是细菌却较难以通过突变来改变其细胞膜的磷脂双分子层的结构，而这恰好是本专利技术的独到之处，本专利技术的重组多肽通过直接在靶细菌的胞膜上形成离子通道而达到杀菌目的。本专利技术中编码肺炎链球菌信号传导多肽的核苷酸序列SEQ ID NO.1所编码氨基酸序列(SEQ ID NO2本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码重组抗肺炎链球菌多肽的核苷酸，其特征在于它含有编码可形成离子通道的大肠菌素或其水性孔道结构域的基因，以及编码肺炎链球菌信号传导多肽的基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丘小庆，
申请(专利权)人：成都阳辉生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]