人工组合的抗葡萄球菌工程多肽及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种人工组合的抗菌工程多肽，该多肽由葡萄球菌信号传导多肽与可形成离子通道大肠菌素或其水性孔道结构域组成，分子结构为大肠菌素或其水性孔道结构域的羧基端与信号传导多肽的氨基端连接，分子量为２０，０００－７０，０００，可分别连接不同致病菌的信号传导多肽而组成对抗该菌的工程多肽。该多肽制备方法是利用点突变技术将葡萄球菌信号传导多肽基因插入到装载在工程质粒里的大肠菌素基因选定的位点上，再将突变质粒转染到工程菌里生产。该抗菌工程多肽优于传统抗菌素之处在于其可以杀灭对现有抗菌素耐药的葡萄球菌，而细菌不易对该多肽产生耐药性；另一优点是可以通过更换信号传导多肽来组成对抗产生该信号传导多肽的任何一种葡萄球菌的抗菌素。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人工组合的抗菌工程多肽及其制备方法，通过制备由不同的E1族可形成离子通道的大肠菌素和葡萄球菌信号传导多肽的功能结构域组合成的工程多肽(Engineered peptide)来达到抗菌目的。
技术介绍
细菌感染仍然是人类生命和健康的主要威胁，自磺胺和青霉素问世以来，人类陆续专利技术的抗菌素主要以通过抑制细菌胞壁合成，抑制或干扰细菌的核酸和蛋白质的代谢与合成等途径来达到抗菌目的，然后这些抗菌途径容易诱使细菌发生突变而产生抗菌耐药性。因此人们一直在致力于开发新的抗菌素。在细菌胞膜上直接形成离子通道而致细菌死亡是比较有前途的抗菌素开发方向之一。自然界中，为数不少的细菌毒素就是以这种机制来杀死细菌的，其模式标本就是大肠杆菌(Escherichia coli)分泌的一种毒素蛋白一大肠菌素(colicin)，1952年Jacob发现其能特异的杀死其他株系的大肠杆菌和相关株系的某些痢疾杆菌，(Jacob et al，Sur Ia biosynthese d’unecolicine et son mode d’action.Annals of the Pasteur Institute.83295-315(1952))。1978年Finkelstein等发现可形成离子通道的大肠菌素可以在人工脂质双分子膜上形成电压依赖性离子通道，从而从根本上揭示了这一类细菌毒素的抗菌机制(Schein et al，Colicin Kacts by forming voltage-dependent channelsin phospholipid bilayer membranes.Nature.276159-163(1978))。1996年Qiu(丘小庆，专利专利技术人)和Finkelstein等揭示了大肠菌素Ia在人工脂质双分子膜上形成的离子通道开放和关闭时的跨膜立体结构(Qiu et al，Major transmembranemovement associated with colicin Ia channel gating.J.Gen.Physiology.107313-328(1996))，为在分子水平上设计和制备新型的抗菌素奠定了结构基础。近二十年，人们逐渐发现细菌也具有随外界环境变化而分泌的信号传导多肽(pheromone)，其作用是调节自身适应环境变化。而且细菌分泌信号传导多肽、制备信号传导多肽的胞膜受体及胞内调节蛋白的基因往往偶联在一起，协调的控制着细菌的生长和分裂。但该方向的研究一直进展缓慢，比如金黄色葡萄球菌的信号传导多肽，Agr D group I(Genebank U85097)，一直到1995年才最后搞清楚是一个八肽(Ji etal，Cell density control of staphylococcal virulence mediated by anoctapeptide pheromone.Proc Natl Acad Sci USA.9212055-12059(1955))，1999年发现在金黄色葡萄球菌对数生长期的早期或中晚期加入人工合成的这种八肽可以刺激或抑制金黄色葡萄球菌的生长(Mayville et al，Structure-activity analysisof synthetic antoinducing thiolactone peptides from staphylococcus aureusresponsible for virulence.Proc Natl Sci USA.961218-1223(1999))。近五年来，人们陆续确定了金黄色葡萄球菌的其他三组AgrD信息素(Genebank AF001783，AF288215，AF001782)，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)信息素(Z49220)和葡萄球菌lugdunensis(S.lugdunensis)信息素(AF173933)的氨基酸系列。如上所述，大肠菌素是一种理想的离子通道抗菌素，缺点是只能作用于大肠杆菌。如果能够利用葡萄球菌特有的信号传导多肽作为诱导物，将大肠菌素或其水性孔道结构域诱导至这些葡萄球菌的胞膜附近形成离子通道来杀伤该致病菌，应该是一种理想的抗菌素开发方向。
技术实现思路
本专利技术针对现有抗菌素性能的不足，提供一种能杀灭对现有抗菌素已经产生耐药性的葡萄球菌的新型抗菌素及其制备方法。本专利技术的技术方案是将可形成离子通道的大肠菌素(colicin El，Ia，Ib，A，B，N)或其水性孔道结构域(pore-formingdomain)与葡萄球菌分泌的信号传导多肽(pheromone)组合成工程多肽。在该工程多肽里，可与葡萄球菌胞膜受体结合的信号传导多肽作为诱导物诱导大肠菌素通道结构域穿过细菌细胞壁与膜间隙到达靶细菌胞膜附近，然后大肠菌素水性孔道结构域在靶细菌胞膜上形成离子通道，使靶细菌胞内内容物泄漏，致靶细菌死亡，从而达到杀菌的目的。工程多肽的制备方法采用由专利专利技术人开发的技术路线(Qiu et al，Site-specific biotinylation of colicin Ia，a probe for protein conformationin the membrane.J Biol Chem 2697483-7488(1994)，Qiu et al，Majortransmembrane movement associated with col icin Ia channel gating.J.Gen.Physiology.107313-328(1996))。该技术路线的关键在于利用点突变技术(美国Strategene公司Quick-change药箱)，将欲组合成的葡萄球菌信号传导多肽基因插入到装载在工程质粒里的大肠菌素基因选定的位点上，制备成人工组合抗菌工程多肽的质粒，再对该突变质粒进行测序以便确认突变成功。最后将突变好的质粒转染到不含质粒的工程菌里制备多肽。信号传导多肽与大肠菌素或其水性孔道结构域的组合方式可以有两种，将信号传导多肽或结合在大肠菌素或其水性孔道结构域的氨基端，或结合在羧基端，于是可以形成四种工程多肽。此外，可以通过改变信号传导多肽和大肠菌素或其水性孔道结构域的肽链的组成及结构来增强其抗菌活性或减少可能出现的副作用。由于这样的组成或改变将会增加或减少组成的工程多肽的氨基酸残基数量，因此其分子量将会在20,000-70,000范围内变动。每一种葡萄球菌都有自己独特的信号传导多肽，因此只要采用其独特的信号传导多肽与可形成离子通道的大肠菌素或其水性孔道结构域连接，就可以组合成一种特异的、对抗该葡萄球菌的抗菌工程多肽。本专利技术制备的人工组成的抗菌工程多肽优于传统抗菌素之处在于其不会诱使细菌产生传统的耐药性，众所周知，细菌可以通过突变产生B-内酰胺酶，减少摄入，变更药物作用位点等手段来改变其细胞壁结构，改变其蛋白质和核酸的代谢等对传统抗菌素产生耐药性。但是细菌却较难以通过突变来改变其细胞膜的磷脂双分子层的结构，而这恰好是本专利技术的独到之处，因为制备的工程多肽就是通过直接在靶细菌的胞膜上形成离子通道来杀菌的。四附图说明附图为金黄色葡萄球菌在改良LB(1％胰蛋白胨，0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工组合的抗葡萄球菌工程多肽，其特征在于该多肽由葡萄球菌信号传导多肽与可形成离子通道大肠菌素或其水性孔道结构域组成，其分子结构为可形成离子通道大肠菌素或其水性孔道结构域的羧基端与信号传导多肽的氨基端连接，或者为信号传导多肽的羧基端与可形成离子通道的大肠菌素或其水性孔道结构域的氨基端连接，分子量为２０，０００－７０，０００。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丘小庆，丘小庆，
申请(专利权)人：成都阳辉生物科技有限责任公司，成都阳辉生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]