一种半纤维素酶及其在制备壳寡糖中的应用制造技术

本发明专利技术是关于一种半纤维素酶及其在制备壳寡糖中的应用，该半纤维素酶是短小芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｐｕｍｉｌｕｓ）半纤酶Ａ１号ＣＣＴＣＣ Ｍ２０１０２３的发酵产物；本发明专利技术壳寡糖的制备方法包括对壳聚糖酶解、酶解液的离心过滤、絮凝澄清、真空浓缩、过滤去杂质、脱色、脱味、超滤分级、干燥，其特征在于对壳聚糖酶解使用前述的半纤维素酶。本发明专利技术的贡献在于提供了高效产酶菌株，且酶的活性大大提高，达３００ｕ／ｍｌ；酶解工艺效率高，仅需８－１０小时；产物中有效组份含量高，壳３－１０糖在７０％以上。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于一种半纤维素酶及其在制备壳寡糖中的应用。
技术介绍
甲壳素是以江、河、湖、海中大量存在的虾、蟹壳为原料进行生产加工的天然动物性膳食纤维。壳聚糖是在浓碱的作用下脱去甲壳素分子中的乙酰基而得到的一种天然高分子化合物，在自然界中的含量仅次于纤维素。甲壳素以具加工方法的不同主要分为以下三个层次的系列衍生产品A.几丁质(甲壳质)，分子量达到100万以上，其吸收能力强，适合工业和环保应用，但不溶于酸碱，也不溶于水，很难被人体吸收。B.几丁聚糖(壳聚糖)，分子量在10万左右，一般只溶于有机弱酸，不溶于水，可以被人体吸收，可以作为食品添加剂及保健品原料等，有着极其广泛的推广价值。C.壳寡糖，分子量低于5000，具水溶性，可直接被人体吸收，速度快，效果显著。已经证明，由壳聚糖降解生成的壳寡糖，更具有独特的生理活性和理化性质，是甲壳素系列产品中应用性能最好的产品。目前，国内外降解制备壳寡糖的方法大致可分为酶降解法、氧化降解法和酸降解法三大类。利用生物酶法降解制备壳寡糖的过程明显优于另两种化学降解法，这是由于酶法降解过程使降解产物的分子量分布更容易被控制，能对降解过程进行监控，生产出有效组份(壳3-10糖)含量较高的壳寡糖，且降解条件比较温和，无需加入大量的反应试剂，对环境污染较少。1999年第二期《中国海洋药物》登载“高产壳聚糖酶菌种的筛选及其降解壳聚糖反应初探”一文论述了中科院大连化学物理生化室通过两轮有效的紫外线诱变，获得了2株具有高产壳聚糖酶的突变株，具有较好的稳定性，其发酵液的粗酶活性达0.2u/ml，尽管其比原始保存突变菌株酶活性提高了8倍，并得到一定量壳寡糖，但其酶活性仍然较低，不能实现工业化生产。壳聚糖降解酶数量众多，降解的壳聚糖酶普遍存在酶活性低、副反应多和酶解时间长、能耗高等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种由微生物发酵产生的半纤维素酶和利用该半纤维素酶制备壳寡糖的工艺方法，使该半纤维素酶具有较高的活性，提高酶解效率，并且使产物中的有效成份即壳3-10糖的含量大大提高，从而使应用半纤维素酶实现工业化生产低聚寡糖成为可能。使用的微生物过快速平板鉴定并通过摇瓶，酶测筛选到了一株可迅速降解壳聚糖为壳寡糖的短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)半纤酶A1号(以下简称半纤酶A1号菌株)，该菌株于2001年7月8日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCM201023，该菌株经优化培养，发酵达到300μ/ml以上的半纤维酶活性。1ml粗酶液可在5～10小时内有效降解10％浓度的壳聚糖为3～10糖为主的寡糖，并经质谱与分析鉴定证实，使工业化生产壳寡糖成为可能。本专利技术使用的半纤酶A1号菌株的性质属短小型杆菌，具芽孢，为革兰氏阳性细菌；菌落形态，圆型，白色，半透明，有光泽，在多聚蛋白胨培养基上较易生长，最适培养温度36℃。本
技术实现思路
包括生产半纤维素酶的产酶工艺和生产壳寡糖的酶解工艺两方面。产酶工艺过程是半纤酶A1号菌株→上罐发酵→低温离心→去杂质→低温保存酶液。应用正交实验法(L4(23)即三因素二水平四次正交实验)进行培养基配方优化，表明产酶稳定，平均酶活力达308u/ml。适宜产酶PH值为6.5，产酶高峰期为12～24小时。酶作用适宜PH值为5.5-6.5，最适宜PH值为6.0，酶作用适宜温度为45℃-48℃，最适温度为48℃，PH值为6.7时稳定性较好，酶的纯化方法一般为盐析，有机溶剂沉淀，离子交换，吸附层析，凝胶过滤，亲和层析，膜分离，低温高速离心等，在生产时采用连续流离心即可，其分离效果好、方便，酶收率在84％以上。酶的产生条件(1)培养基成份对产酶的影响应用正交试验法对中糊精、胰蛋白胨、酵母抽提物用3种主成份进行了优化，结果如表面1。对表1试验结果分析计算，发现各因素对酶活力影响的主次为B＞C＞A，其优化配方为中糊精10％、胰蛋白胨1％、酵母抽提物0.5％。按优化酶方重现实验表明产酶稳定，平均酶活力达308u/ml。L4(23)表面化培养基配方优化方案表(L4(23)即三因素二水平四次正交试验) .发酵工艺对产生酶的影响A.PH值对产酶的影响由摇瓶试验应用0.618对培养基起PH值进行优选。结果见表二。表明适宜产酶PH值为6.5。表2培养基PH对产酶的影响 B.产酶时间过程于不同培养时间取样，测试酶活性，结果见表3表3产酶时间过程 分析表明12-24h为产酶高峰期，在24h达到最高水平，延迟后酶活性下降，可能是营养消耗，菌体自溶。C.溶氧短小芽孢杆菌是好气性细菌，在发酵过程中需要消耗大量溶氧；提高搅拌转速，加在通风量均能有效提高溶氧。经试验，选定的搅拌转速为350-500r/min(随着发酵时间的延长逐渐提高转速)，通风量在发酵过程中，通气不间断在0-16h，通气量为0.8m3/min；在16-24h通气量为0.6m3/min，全过程的溶氧值控制在65％～85％之间。D.消泡剂产酶发酵过程中会产生大量泡沫，由于泡沫的表面张力会使酶的活力降低，因此要及时消泡，根据发酵情况通过蠕动泵向罐中自动加聚醚类消泡剂。本专利技术半纤维素酶的一般性质A.酶作用最适PH值于不同PH值条件下进行酶反应。酶作用适宜PH值为5.5～6.5，最适PH值为6.0。B.酶作用最适温度于不同温度条件下进行酶反应。酶作用适温度为45～48℃，最适温度为50℃。C.PH值对酶稳定性的影响酶于不同PH值缓冲体系中保存15min，测酶活表明PH值6.7时稳定性较好。D.PH值对酶稳定范围性的影响酶于0.05mol/L，PH6.0的磷酸缓冲液中，在不同温度保温15min，结果表明该酶热稳定性较差，60℃保温15min，酶活仅剩余22％，故应在低温下保存。酶的纯化半纤维素酶常和其他酶共同存在于发酵体系中，且自身还有多种分子型，因而纯化较困难。一般采用的方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换、吸附层析、凝胶过滤、亲和层析、膜分离、低温高速离心等，考虑到生产的要求，可采用连续流离心即可，其分离效果好，方便，酶收率在84％以上。本专利技术生产壳寡糖的酶解工艺过程是壳聚糖冰乙酸溶液→入罐酶解→离心、絮凝、过滤、去杂质→脱色、脱味、分级→冻干(喷干)→壳寡糖酶解工艺根据壳聚糖原料的溶解性差异，对应壳聚糖的量不同，一般是0.2ml冰乙酸(95％)比1g壳聚糖即能使壳聚糖充分溶解又不过量。冰乙酸溶液的浓度按底物浓度的变化来调节，比如如果要求达到10％的底物浓度，每g壳聚糖对应0.2ml95％的冰乙酸，配100ml溶液需要壳聚糖10g，冰乙酸2ml，蒸馏水100ml。壳聚糖原料的性状不同，则加酶量也不同。为了得到特定分子量分布的产品，可通过底物浓度、加酶量、酶解时间的改变来调控。本专利技术与现有技术相比具有以下突出特点1.高效产酶菌株目前，一般菌株发酵产壳聚糖酶的周期在6-7天(参阅《中国海洋药物》1999年第二期“高产壳聚糖酶菌株的筛选及降解壳聚糖反应初探”一文)，本专利技术采用的菌株则是通过诱变、筛选出的高效菌株，发酵周期仅需18-24小时，产酶效率大大提高。2.酶的活性大大提高现有壳聚糖酶的酶活性仅为0.2u/ml，而本专利技术提供的酶则是高活性半纤维素酶，酶活性达300u/ml。(酶活力的测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种短小芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｐｕｍｉｌｕｓ）的筛选培育品短小芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｐｕｍｉｌｕｓ）半纤酶Ａ１号，其保藏号为ＣＣＴＣＣ Ｍ２０１０２３。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴健，
申请(专利权)人：武汉东湖生物技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]