不饱和透明质酸奇数寡糖的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种不饱和透明质酸奇数寡糖的制备方法，主要选用微生物透明质酸酶酶解透明质酸，再经低压层析色谱柱分离纯化，最后用体积排阻色谱法脱盐，即得一系列不饱和透明质酸奇数寡糖，其分子式为C6+14nH8+21nO6+11nNn，分子量为176.0320+(379.1146)n道尔顿，聚合度为2n+1，5≥n≥1。本发明专利技术的制备方法不仅操作简便、耗时较短，而且得糖率高，纯度达到百分之百，克服了现有合成和降解技术难以快速制备一系列不饱和透明质酸奇数寡糖的困难。本发明专利技术制得的不饱和透明质酸奇数寡糖为进一步研究低聚合度透明质酸的构效关系，以及指导其未来在临床、食品和化妆品等领域的应用提供了重要的价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体涉及不饱和透明质酸奇数寡糖(即还原端和非还原端为葡萄糖醛酸的不饱和透明质酸奇数寡糖)及其制备方法。
技术介绍
透明质酸(HA)是由D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)二糖单位通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接的一种线性大分子酸性粘多糖。HA广泛分布于细胞外基质、软结缔组织以及体液。HA通过调节细胞活动而参与到许多病理学和生理学过程。透明质酸具有良好的亲水性、粘弹性、和润滑性，被广泛应用于临床、化妆品、食品等领域。据报道，不同分子量的HA具有不同的理化性质和生物活性，适用于不同的目的。低分子量HA，尤其是二糖、三糖、四糖、五糖因其表现出独特的理化性质，受到广泛关注。目前，HA常用的降解方法有化学降解、物理降解和酶降解。酶降解因降解过程可控，降解产物明确，而受到了广泛的应用。根据作用机制的不同，将透明质酸酶分为三种：一、哺乳动物透明质酸酶，切割β-1,4糖苷键，最终产生非还原端为GlcA的四糖，中国专利文件CN101283979A(申请号：200810038558.3)公开了用哺乳动物透明质酸酶-牛睾丸透明质酸酶制备一种促进伤口愈合的透明质酸小片段药膏的制备；二、水蛭透明质酸酶，切割β-1,3糖苷键，最终产生非还原端为GlcNAc的四糖和六糖；三、微生物透明质酸酶，切割β-1,4糖苷键，最终产生非还原端为不饱和葡萄糖醛酸(△UA)的四糖和六糖。将哺乳动物透明质酸酶降解产物用酸或者碱处理，还原端GlcNAc发生脱落，从而得到饱和奇数寡糖(CharlesD.Blundell,AndrewAlmond.Enzymaticandchemicalmethodsforthegenerationofpurehyaluronanoligosaccharideswithbothoddandevennumbersofmonosaccharideunits.AnalyticalBiochemistry,2006,353:236-247)。碱处理制备奇数寡糖：以CH3COONH4为酶解工作液，用牛睾丸透明质酸酶降解HA。通过反复冻干除CH3COONH4，将寡糖溶解在40mMNaOH，反应30min，用HCl终止反应，再通过阴离子交换柱(Sepharose-Q)进行纯化，以氯化钠为流动相62.5-205mM梯度洗脱58min。酸处理制备奇数寡糖：以CH3COONH4为酶解工作液，用牛睾丸透明质酸酶降解HA，在沸水中加热5min除酶，离心，取上清，在pH5.2的沸水浴中孵育3h，冷却至室温，再经阴离子交换柱分离纯化。以上两种方法虽均能成功制备出HA奇数寡糖，但存在以下几个弊端：1、这两种方法均选用CH3COONH4为酶解工作液，CH3COONH4对后续降解过程会产生影响，需要花时间将其去除；2、HA寡糖在酸性或碱性条件下还原端GlcNAc发生脱落，从而得到HA奇数寡糖，但反应效率较低；3、反应过程中还会出现降解副产物-异构体，且无法通过现有分离技术将其分开，反应产物结构不单一。因此整个制备HA奇数寡糖的过程耗时较长、过程较为复杂，且得率较低，没有得到广泛的应用和关注。因此，一种简便、高效、经济的制备透明质酸奇数寡糖方法显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种不饱和透明质酸奇数寡糖(即还原端和非还原端为葡萄糖醛酸的不饱和奇数寡糖)及其制备方法，该方法具有简便、高效、经济等优点，以弥补现有制备方法上的不足。本专利技术的技术方案是：一种不饱和透明质酸奇数寡糖，其分子式为C6+14nH8+21nO6+11nNn，分子量为176.0320+(379.1146)n道尔顿，聚合度(dp)为2n+1，其结构式为：其中，5≥n≥1。不饱和透明质酸奇数寡糖的制备方法，主要将透明质酸经过酶解、分离纯化和脱盐三个步骤制得一系列不饱和透明质酸奇数寡糖，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：步骤1)将冻干粉末状透明质酸用纯水配成浓度为8-10mg/mL的透明质酸溶液，将冻干粉末状微生物透明质酸酶用酶解工作液配成150-200IU/mL的透明质酸酶溶液；步骤2)取所述透明质酸溶液5-8份，在冰浴条件下加入所述透明质酸酶溶液1-2份，震荡混匀，在35-40℃水浴箱中孵育24-36h，制成样品；将所述样品移至95-100℃水浴锅中，加热5-7min，离心，去沉淀；步骤3)利用低压层析色谱柱对去沉淀后的所述样品进行分离纯化，其中流动相浓度为0.1-0.2M，流速0.1-0.2mL/min，平衡后上样1mL，示差检测器检测，馏分收集器10-12min/管收集，合并收集，再通过旋转蒸发仪进行浓缩，获得一系列不饱和透明质酸奇数寡糖粗品；步骤4)将获得的不饱和透明质酸奇数寡糖粗品利用体积排阻色谱柱分别进行除盐，纯水为流动相，流速0.1-0.2mL/min，平衡后上样1mL，示差检测器检测，馏分收集器10-12min/管收集，浓缩，冻干，即制得一系列不饱和透明质酸奇数寡糖纯品。进一步的技术方案，步骤1)中，所述酶解工作液为纯水。进一步的技术方案，步骤1)中，所述微生物透明质酸酶来源于Streptomyceshyalurolyticus。进一步的技术方案，步骤3)中，所述低压色谱柱的填料为Bio-gelP4、Bio-gelP6或Bio-gelP10。进一步的技术方案，步骤3)中，所述低压色谱柱的流动相为氯化钠或氯化钾。进一步的技术方案，步骤4)中，所述体积排阻色谱柱的填料为SephadexG10、SephadexG25或SephadexG50。本专利技术的优点是：1.本专利技术的制备方法选用了一种具有独特降解方式的微生物透明质酸酶。经探索这种来源于Streptomyceshyalurolyticus透明质酸酶在特定酶解条件下能产生奇数寡糖；2.本专利技术的制备方法选择在纯水中酶解，而没有采用缓冲盐，这样避免了后续脱盐以及缓冲盐对低压色谱分离的影响；3.本专利技术的制备方法通过酶解最终得到了结构式为△UA(-GlcNAc-GlcA)n的一系列不饱和透明质酸奇数寡糖，收率较高；4.上述寡糖混合物经高温除酶后直接使用简单的低压柱色谱分离，便可得到本专利技术所需制备的一系列不饱和透明质酸奇数寡糖纯品，相对于碱解和酸解，大大简化了不饱和透明质酸奇数寡糖的制备工艺，最终产物结构单一，纯度达到百分之百，并提高了制备效率；5.本专利技术的制备方法克服了现有合成和降解技术难以快速制备大量一系列不饱和透明质酸奇数寡糖的困难，为进一步探索低聚合度寡糖构效关系，以及指导其在临床、食品和化妆品等方面的应用具有重要的现实意义。附图说明图1为本专利技术利用透明质酸酶酶解透明质酸的降解产物分析结果；图2a为本专利技术所制备的△UA-GlcNAc-GlcA的质谱图；图2b为本专利技术所制备的△UA(-GlcNAc-GlcA)2的质谱图；图2c为本专利技术所制备的△UA(-GlcNAc-GlcA)3的质谱图；图2d为本专利技术所制备的△UA(-GlcNAc-GlcA)4的质谱图；图2e为本专利技术所制备的△UA(-GlcNAc-GlcA)5的质谱图。具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述：一种不饱和透明质酸奇数寡糖，其分子式为C6+14nH8+21nO6+1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种不饱和透明质酸奇数寡糖，其特征在于：其分子式为C6+14nH8+21nO6+11nNn，分子量为176.0320+(379.1146)n道尔顿，聚合度(dp)为2n+1，其结构式为：其中，5≥n≥1。

【技术特征摘要】
1.一种不饱和透明质酸奇数寡糖，其特征在于：其分子式为C6+14nH8+21nO6+11nNn，分子量为176.0320+(379.1146)n道尔顿，聚合度(dp)为2n+1，其结构式为：其中，5≥n≥1。2.一种如权利要求1所述的不饱和透明质酸奇数寡糖的制备方法，主要将透明质酸经过酶解、分离纯化和脱盐三个步骤制得一系列不饱和透明质酸奇数寡糖，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：步骤1)将冻干粉末状透明质酸用纯水配成浓度为8-10mg/mL的透明质酸溶液，将冻干粉末状微生物透明质酸酶用酶解工作液配成150-200IU/mL的透明质酸酶溶液；步骤2)取所述透明质酸溶液5-8份，在冰浴条件下加入所述透明质酸酶溶液1-2份，震荡混匀，在35-40℃水浴箱中孵育24-36h，制成样品；将所述样品移至95-100℃水浴锅中，加热5-7min，离心，去沉淀；步骤3)利用低压层析色谱柱对去沉淀后的所述样品进行分离纯化，其中流动相浓度为0.1-0.2M，流速0.1-0.2mL/min，平衡后上样1mL，示差检测器检测，馏分收集器10-12min/管收集，合并收集，再通过旋转蒸发仪进行浓缩，获得一系...

【专利技术属性】
技术研发人员：张真庆，陶蕾，李笃信，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32