一种巴戟天耐斯糖含量测定方法技术

本发明专利技术提供一种利用软件扫描薄层图像测定巴戟天耐斯糖薄层定量检测方法，利用梯形积分法对色谱峰进行积分，根据峰面积和样品浓度的关系进行定量分析。该方法操作简单，可以代替传统薄层扫描仪。

【技术实现步骤摘要】
一种巴戟天耐斯糖含量测定方法
本专利技术涉及医药领域，尤其是涉及一种巴戟天耐斯糖薄层定量检测方法。
技术介绍
中药巴戟天为双子叶植物茜草科巴戟天MorindaofficinalisHow的干燥根。巴戟天药食同源，《神农本草经》将其归为上品，也是中国著名的“四大南药”之一。性甘、辛、微温，归肾、肝经，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿的功能，用于阳痿遗精，宫冷不孕，月经不调，少腹冷痛，风湿痹痛，筋骨痿软等。近年来对巴戟天的化学研究表明其中含有蒽醌、环烯醚萜及其苷类、有机酸、糖类等成分。其中占有绝对含量优势的寡糖是其主要的活性成分，其它成分含量较少。研究报导巴戟天中分离的寡糖具有抗氧化、抗应激、抗抑郁、抑制凋亡等药理活性。因此，寡糖含量成为药材质量优劣的一个重要指标。由于寡糖类成分没有强紫外吸收，常规的紫外检测器不适合测定分析。对于寡糖类的检测多采用示差折光、蒸发光散射、脉冲安培、荷电气溶胶、质谱等方法，除此之外，采取柱后衍生化检测荧光的方法也可用于其测定分析。目前测定方法多需要昂贵精密的仪器及复杂的样品处理过程。薄层色谱技术以其快速、低成本、高信息量、低技术门槛在现代分析如医药、食品、化工领域仍居于重要地位。本专利技术的目的在于提供一种基于薄层色谱的含量测定方法，新方法利用软件扫描薄层图像而代替传统薄层扫描仪。
技术实现思路
本专利技术提供一种利用软件扫描薄层图像测定巴戟天耐斯糖薄层定量检测方法。该方法操作简单，可以代理传统薄层扫描仪。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种巴戟天耐斯糖薄层定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)溶液制备：包括巴戟天供试品溶液和耐斯糖对照品溶液；(2)展开及显色：将所得供试品溶液和对照品溶液条带状点样至高效薄层预制板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸为展开剂进行展开并晾干，将薄层板浸入含有浓硫酸的乙酸乙酯石油醚的混合溶液的显色剂中数秒，取出晾干，置于薄层加热板上至斑点清晰；(3)成像及图像处理：将经步骤2显色的薄层板置于紫外灯下拍照，将照片导入图像处理软件，软件对样品条带进行扫描，分离RGB值并进行逐行累加，然后利用梯形积分法对色谱峰进行积分，根据峰面积和样品浓度的关系进行定量分析。步骤(1)中所述的供试品溶液制备方法：将巴戟天细粉用含水甲醇或水超声提取15-30分钟，滤过，滤液并定容即得。所述的含水甲醇为50-80％甲醇，优选60％甲醇。优选将巴戟天药材干燥粉碎成细粉，用水或60％甲醇超声提取20分钟，滤过，滤渣用水洗涤，合并滤液定容即可。优选取巴戟天药材使用前置于60℃干燥箱内过夜，粉碎并过20目筛，精密称定，置于锥形瓶中，加水超声80kHz提取20min，滤过，滤渣以少许水洗涤，合并滤液并定容，摇匀，通过0.45μm微孔滤膜，取续滤液制得供试品溶液20mg/ml。所述对照品制备：取耐斯糖对照品，精密称定，加水溶解并稀释至刻度，摇匀制得每含1.586mg/mL耐斯糖的对照品储备液。精密吸取适量加水稀释制得系列浓度对照品溶液。所述的系列浓度分别为1.190、0.893、0.670和0.446mg/mL本专利技术步骤(2)中所述的展开剂乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸＝8:3：(2-2.5)：3，优选乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸＝8:3:2.3:3。展开剂中水的比例对耐斯糖的Rf值影响较大，但是过低的有机相比例会引起条带的过度扩散而影响分离度。显色剂的均匀程度直接影响到定量结果的分析及准确性，因为显色剂的选择及配比对于薄层色谱来说是非常重要的，为了保证显色剂的均匀与不引起斑点的扩散，本专利技术步骤(2)中优选显色剂：含有1-2.5％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚5-7:5-3的混合溶液，加热显色5-12min。进一步优选显色剂为2％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚7:3的混合溶液，并采用浸板的方式，加热10分钟显色。显色剂中的浓硫酸的浓度对色谱峰信号有影响，浓度为2％时色谱峰信号较强，且不会引起斑点糊化。本专利技术所述的薄层板是预制硅胶板GF254，优选预制SILG-25UV254薄层板。本专利技术步骤(2)的所述的点样方法，条带状点样，条带宽度：4mm；条带间距：10mm；距底边距离：8mm；点样量：2μL。本专利技术步骤(2)优选点样后的薄层板，在展开前需要干燥4h以上。本专利技术步骤(3)中所述的拍照是指在紫外灯下拍照参数：曝光时间2000-6000ms，增益1.0，累积关闭。优选曝光5000ms。本专利技术步骤(3)中所述的薄层图像导入至图形处理软件中对各条带进行数码扫描，分离RGB值并进行逐行累加利用梯形积分法获得相应色谱峰的积分值。所述的图形处理软件是指，优选TLCImageProcessor软件，更优选TLCImageProcessor3.0版软件所述的RGB值是指构成图像像素的红、绿、蓝三原色的值，三种值相互叠加可得到各式各样的颜色。所述的梯形积分法是指：将色谱峰按照一定的步长划分为尽可能多的区间，每个区间的面积可以近似的用梯形面积计算公式求得，色谱峰的面积等于各区间面积之和。划分的区间数越多，误差越小，公式为：在区间[a,b]上，本专利技术的有益效果1、由于显色的均匀程度直接影响到定量结果的分析，为了保证显色剂的均匀与不引起斑点的扩散，本专利技术的第一个重要附加技术特征在于用1-2.5％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚5-7:5-3的混合溶液浸板的方式进行显色。2、为了降低检测的成本，不依赖于精密昂贵的检测器，本专利技术的第二个重要附加技术特征在于利用软件扫描薄层图像的方式代替传统的薄层扫描仪：图像导入软件后，对选取条带进行逐行像素扫描，分别累加各自的RGB值及总值，输出包含色谱峰的曲线至窗口中，然后利用梯形积分法对色谱峰进行积分获取峰面积。3、为了降低薄层板背景的干扰，本专利技术的第三个重要附加技术特征在于利用分离出的红色通道(R)数值进行积分计算，这是由于薄层板背景偏蓝色，使用分离出的红色值可避免背景干扰，有效避免了基线的漂移。为了更好的体现上述有益效果，通过下述试验例说明本专利技术建立了一种不依赖于薄层扫描仪的薄层定量方法，以软件代替实体扫描仪，对巴戟天中耐斯糖含量进行了测定，方法学验证显示该法具有良好的专属性、精密度、稳定性及准确度，可作为一种快速、低成本、低门槛的定量检测方法，可用于巴戟天药材质量控制。2010版中国药典规定，巴戟天药材的耐斯糖含量不得低于2％。实际收集的样品中，只有批号为130501的一批药材不符合规定。经与其他药材外形比对分析发现，该药材比较细，推测原因为生长年份较短，次生代谢产物积累不够。试验例一、方法学考察1.材料、试剂与仪器1.1.标准品耐斯糖(批号：AWG0714，纯度99.0％)，日本和光纯药工业株式会社蔗糖(批号111507-201303：，纯度99.8％)，中国食品药品检定研究院葡萄糖(批号110833-201303：，纯度100％)，中国食品药品检定研究院果糖(批号100231-201305：，纯度99.4％)，中国食品药品检定研究院1.2.试剂乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸分析纯均购自广州化学试剂厂，水由三重蒸馏水系统制得。1.3.样品收集巴戟天药材收集自广东省德庆市药材市场，品种经广州万正药业有限公司谢培山教授鉴定为MorindaofficinalisHow。批号分别为100201,100401,100本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种巴戟天耐斯糖薄层定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)溶液制备：包括巴戟天供试品溶液和耐斯糖对照品溶液；(2)展开及显色：将所得供试品溶液和对照品溶液条带状点样至薄层预制板上，以乙酸乙酯‑甲醇‑水‑冰醋酸为展开剂进行展开并晾干，将薄层板浸入含有浓硫酸的乙酸乙酯石油醚的混合溶液的显色剂中数秒，取出晾干，置于薄层加热板上至斑点清晰；(3)成像及图像处理：将经步骤2显色的薄层板置于紫外灯下拍照，将照片导入图像处理软件，软件对样品条带进行扫描，分离RGB值并进行逐行累加，然后利用梯形积分法对色谱峰进行积分，根据峰面积和样品浓度的关系进行定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种巴戟天耐斯糖薄层定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)溶液制备：包括巴戟天供试品溶液和耐斯糖对照品溶液；所述的供试品溶液制备方法：将巴戟天药材干燥粉碎成细粉，用水超声提取15-30分钟，滤过，滤渣用水洗涤，合并滤液定容即可；(2)展开及显色：将所得供试品溶液和对照品溶液条带状点样至薄层预制板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸＝8:3:2.3:3为展开剂进行展开并晾干，将薄层板浸入含有1-2.5％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚5-7：5-3的混合溶液的显色剂中数秒，取出晾干，置于薄层加热板上显色加热5-12min；(3)成像及图像处理：将经步骤2显色的薄层板置于紫外灯下拍照，将照片导入图像处理软件，软件对样品条带进行扫描，分离RGB值并进行逐行累加，然后利用梯形积分法对色谱峰进行积分，根据峰面积和样品浓度的关系进行定量分析。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的紫外灯下拍照参数：曝光时间2000-6000ms，增益1.0，累积关闭。3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的薄层图像导入至TLCImageProcessor3.0版图形软件中对各条带进行数码扫描，分离RGB值并进行逐行累加获得相应色谱峰的积分值。4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)溶液制备：对照品溶液配制：取耐斯糖对照品，精密称定，加水溶解并稀释至刻度，摇匀制得每含1.586mg/mL耐斯糖的对照品储备液，精密吸取适量加水稀释制得系列浓度对照品溶液；供试品溶液的配制：巴戟天药材使用前置于60℃干燥箱内过夜，粉碎并过20目筛，精密称定，置于锥形瓶中，加水超声80kHz提取20min，滤过，滤渣以少许水洗涤，合并滤液并定容，摇匀，通过0.45μm微孔滤膜，取续滤液制得供试品溶液20mg/ml；(2)展开及显色：薄层板：预制UV254薄层板，预饱和时间：15min；展开剂：乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸8:3:2.3:3,v/...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙帅，许舜军，杨柳，许艺镌，许铮弟，张和灿，
申请(专利权)人：广州浩意万医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44