生产包膜病毒的方法技术

本发明专利技术涉及一种在弱酸性培养基中生产包膜病毒的方法。本发明专利技术的方法可用于在符合良好操作规范(或GMP)的条件下大规模生产和回收包膜病毒。

Method for producing enveloped virus

The invention relates to a method for producing enveloped virus in weak acid medium. The method of the present invention can be used for mass production and recovery of enveloped viruses under the conditions of good operating conditions (or GMP).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种生产包膜病毒的方法，所述包膜病毒在弱酸性培养基中通过细胞培养来生产。本专利技术的方法可用于生产这些病毒粒子以应用于生物医学或生物技术研究，以便当生产在观察到良好操作规范(GMP)的条件下大规模进行时，显著提高产品收得率。
技术介绍
包膜病毒载体以及尤其是慢病毒载体例如源自于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的病毒载体，在基因治疗方法领域中是有希望的工具。然而，临床等级的这些载体的大量生产目前仍是一种挑战。为了改进它们的生产已提出了几种方法：优化生产所述载体所需的质粒在宿主细胞中的转染(例如转染试剂、细胞密度、质粒比率等的优化)，或聚焦于特定细胞代谢途径的细胞培养条件的优化(例如添加脂类、胆甾醇、氯喹、丁酸钠等)(Ansorge等，2010；Schweizer和Merten，2010)。本专利技术人具有扩展这一领域和优化物理化学参数的想法，更具体来说对pH条件感兴趣。培养基pH的中性被认为是培养哺乳动物细胞的关键参数。此外，一项研究报道了具有水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白(VSV–G)的假型慢病毒在磷酸盐缓冲液中在pH6下不稳定(Higashikawa和Chang2001)。考虑到这些因素，本领域技术人员认为降低培养基的pH将对包膜病毒的生产具有负面影响。专利技术概述本专利技术源自于下述观察，即当将生产包膜病毒的细胞在弱酸性培养基中培养时，所述病毒的生产得到提高。所述弱酸性条件以相当令人吃惊的方式提供了生产具有比在常规使用的中性培养基中获得的高2至3倍的感染滴度的病毒的可能性。因此，本专利技术的目的是将弱酸性条件用于生产包膜病毒。更具体来说，本专利技术涉及一种生产包膜慢病毒载体的方法，其特征在于用于培养生产所述载体的宿主细胞的培养基是弱酸性培养基。专利技术详述因此，本专利技术涉及一种生产包膜载体的方法，其特征在于所述载体在弱酸性条件下生产。表述“弱酸性条件”是指水性溶液的pH在5至6.6之间，特别是5.5至6.6之间或5至6.2之间，更特别是在5.8至6.2之间。尤其是pH等于5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1或6.2。根据特定实施方式，pH为约6。所选的pH也取决于所使用的培养基的缓冲能力，本领域技术人员能够根据他/她的常识容易地确定所述缓冲能力。本领域技术人员可以改变溶液的pH，尤其是细胞培养基的pH。尤其是，他/她可以在所述溶液中引入酸、尤其是强酸例如盐酸溶液。如果需要，可以使用碱、尤其是强碱例如氢氧化钠溶液重新调整pH，以将它带到所需值。除了作为本专利技术的目的的弱酸性条件之外，用于生产包膜病毒的方法还应用本领域中公知的方法和材料。在领域技术人员可以参考他/她的在生产包膜病毒方面的常识，尤其是由文献所说明的常识(Ansorge等，2010；Schweizer和Merten，2010；Rodrigues等，2011)。在本专利技术的范围内，术语“病毒”是指在自然界中存在的天然病毒和基因组相对于它所源自的亲本病毒的基因组来说包含修饰的修饰病毒两者。这可以是减毒病毒，其与它所源自的天然病毒相比已失去其全部或部分致病力。它的基因组在细胞培养物中或在活生物体内连续传代期间被体内修饰。术语“病毒”也可以是指重组病毒，其基因组通过遗传工程技术在体外修饰。所述修饰可以例如允许失活至少一个对病毒复制来说必需的基因(使病毒对复制缺陷)和/或插入编码蛋白质或异源RNA(其通常不被天然病毒编码)的DNA片段。在后一种情况下，这被称为“病毒载体”。插入发生在病毒基因组的适合区域中，以便允许在靶细胞中表达所述异源DNA片段。术语“病毒”还指假病毒粒子，即在其表面没有任何包膜糖蛋白或没有基因组并且通过病毒的结构和/或酶蛋白的自发装配获得的病毒粒子。根据特定实施方式，所述包膜病毒是病毒载体。所述病毒载体尤其源自于反转录病毒，例如慢病毒。按照本专利技术生产的反转录病毒载体尤其源自于α–反转录病毒(例如禽白血病病毒ALV)、β–反转录病毒(例如小鼠乳腺肿瘤病毒MMTV)、γ–反转录病毒(例如不同类型的鼠白血病病毒MLV)、δ–反转录病毒(例如不同类型的人T淋巴细胞病毒HTLV)、ε–反转录病毒(例如大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒WDSV)、泡沫病毒(例如人泡沫病毒HFV和猴泡沫病毒SFV)、灵长类慢病毒例如不同类型的人免疫缺陷病毒(人免疫缺陷病毒HIV)、不同类型的猴免疫缺陷病毒(猴免疫缺陷病毒SIV)或非灵长类哺乳动物的慢病毒例如马传染性贫血的病毒(马传染性贫血症病毒EIAV)、猫免疫缺陷病毒(猫免疫缺陷病毒FIV)、山羊关节炎-脑炎的病毒(山羊关节炎-脑炎病毒)或绵羊维斯纳-梅迪病毒(维斯纳梅迪病毒VMV)。根据特定实施方式，所述反转录病毒载体特别是慢病毒载体是假型的，即它包含源自于与所述反转录病毒粒子所源自的病毒不同的病毒的包膜糖蛋白、修饰的包膜糖蛋白或嵌合的包膜糖蛋白。根据特定实施方式，所述反转录病毒载体是假型的，并具有源自于水泡性口炎病毒(VSV–G)或长臂猿白血病病毒(长臂猿白血病病毒GALV)的包膜蛋白，尽管本领域技术人员可以设想使用其他病毒的包膜糖蛋白(Frecha等，2008)。根据特定实施方式，所述反转录病毒载体、更具体为慢病毒载体是假型的，并具有修饰的包膜糖蛋白例如GALVTR(GALV的包膜糖蛋白，其中病毒子内的C–末端已被双嗜性人致白血病病毒A–MLV的包膜糖蛋白的C–末端代替，因此允许将包膜糖蛋白高效并入慢病毒粒子中)(Christodoulopoulos和Cannon，2001)。根据特定实施方式，所述反转录病毒载体、更具体为慢病毒载体是假型的，并具有嵌合的包膜糖蛋白例如麻疹病毒的包膜糖蛋白，其中已插入有编码免疫球蛋白的重链和轻链的可变区(单链可变片段scFv)的融合蛋白或具有重复的锚蛋白结构域的蛋白(设计的锚蛋白重复序列蛋白DARPins)，以便允许特异性靶向靶细胞表面处的给定受体(Anliker等，2010；Munch等，2011)。根据特定实施方式，用于为反转录病毒载体、更具体为慢病毒载体形成假型的病毒包膜糖蛋白，源自于属于下述科的病毒的包膜糖蛋白：弹状病毒科，尤其是水泡病毒属(例如VSV–G)或狂犬病毒属(例如狂犬病毒、莫科拉病毒)；砂粒病毒科(例如淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV))；披膜病毒科，更具体为甲病毒属(例如罗斯河病毒(RRV)、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)、委内瑞拉马脑炎病毒、西部马脑炎病毒)；丝状病毒科，更具体为丝状病毒属(埃博拉病毒、拉沙病毒)；反转录病毒科，更具体为α反转录病毒属(例如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产包膜病毒的方法，其特征在于将生产所述病毒的宿主细胞在弱酸性培养基中培养。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.16 FR 13589091.一种生产包膜病毒的方法，其特征在于将生产所述病毒的宿主细胞在弱酸性培养基
中培养。
2.权利要求2的方法，所述培养基的pH在5.8至6.2之间，更具体来说所述pH为约6。
3.权利要求1至2任一项的方法，所述包膜病毒是反转录病毒，任选为假型的反转录病
毒。
4.权利要求1至3任一项的方法，所述包膜病毒是慢病毒，任选为假型的慢病毒。
5.权利要求4的方法，所述反转录病毒是假型的，并具有选自VSV–G包膜蛋白或GALV包
膜蛋白的包膜蛋白。
6.权利要求5的方法，所述慢病毒是假型的，并具有选自VSV–G包膜蛋白或GALVTR包膜
蛋白的包膜蛋白。
7.前述权利要求任一项的方法，所述宿主细胞选自HEK293、HEK293T、HEK293FT、Te671、
CEM、NIH–3T3、Mpf或D17细胞。
8.前述权利要求任一项的方法，所述方法包括下列步骤：
-利用编码生产所述包膜载体所需的元件的一种或几种质粒瞬时转染HEK293T细胞；
-将所述细胞在适合的培养基中培养，所述培养基的pH为约6；
-收获培养物上清液中的包膜病毒。
9.权利要求8的方法，对于生产慢病毒来说，利用4种质粒转染所述细胞：一种质粒带有
包含慢病毒的gagpol基因的表达盒，一种质粒带有包含慢病毒的rev基因的表达盒，一种转...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·弗纳尔，
申请(专利权)人：吉尼松公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR