一种麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体及其编码基因、重组质粒、宿主细胞与应用，该酶属于酰基-酰基载体蛋白脱氢酶，具有良好水溶性，与野生型Δ9脂肪酸脱氢酶相比，使酵母细胞的总脂肪酸、不饱和脂肪酸及饱和脂肪酸的产量均提高1倍。该编码基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列或该核苷酸序列的片段、类似物和衍生物。Δ9脂肪酸脱氢酶突变基因共有25个核苷酸发生突变，导致20个氨基酸发生突变，氨基酸序列见SEQIDNO:2所示。本发明专利技术还提供含有该基因核苷酸序列的可进行功能性表达的重组质粒、含有该重组质粒的细胞生物体及其子代、用上述重组质粒或含有该重组质粒的细胞生物体及其子代提高不饱和脂肪酸产量的方法及其在酵母发酵生产油脂方面的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
和遗传工程领域,具体涉及麻疯树(Jatropha curcas)的A9脂肪酸脱氢酶突变体、其编码基因、重组质粒、宿主细胞与应用。
技术介绍
麻疯树(Jatropha curcas)又名小桐子，为大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha)，广泛生长在亚洲、非洲和拉丁美洲等国家和地区。麻疯树是一种多用途的含油灌木植物，除作绿篱栽植外，其有效成分可以用于土壤和水资源防护、抗艾滋、杀菌剂生产、、生物柴油、肥皂和蜡烛生产等。麻疯树的最大价值在于其种子油可以作为生物柴油。研究显示麻疯树的种子含油量高达50飞0%，每公顷产油可达2700公斤左右。因此，麻疯树也成为当前生产生物柴油的最具开发价值和应用前景的作物之一。印度、东南亚以及我国等多个国家和地区已经将麻疯树生产生物柴油列为生物能源开发的重点领域。研究麻疯树的脂肪酸合成和调控基因，可为进一步进行基因工程改造、获得高产油的优良品种奠定基础，具有重要意义。油酸(C18:l)和亚油酸(C18:2)等不饱和脂肪酸是麻疯树种子油的主要组分，其含量分别占种子油总量的50%和30%左右。脂肪酸脱氢酶(脂肪酸去饱和酶)可以将脂肪酸链上的C-C单键转化为C=C双键，产生不饱和脂肪酸。脂肪酸去饱和酶分为三类酰基辅酶A去饱和酶、酰基-酰基载体蛋白(ACP)去饱和酶和酰基脂肪去饱和酶(Murata N，WadaH，Biochem J，1995. 300: 1_8)。在植物和蓝细菌中，大部分去饱和反应由酰基脂肪去饱和酶完成，其将双键引入到以酯形式存在的脂肪酸中。在植物细胞的质体中存在酰基-酰基载体蛋白去饱和酶，可以将双键引入到与酰基载体蛋白结合的脂肪酸中。在动物、酵母、霉菌中广泛存在酰基辅酶A去饱和酶可将双键引入到与辅酶A结合的脂肪酸中。目前只有植物的酰基-酰基载体蛋白去饱和酶是唯一可知的可溶性去饱和酶家族，它包括A 9-硬脂酰ACP脱氢酶、A 4-软脂酰ACP脱氢酶、A 6-软脂酰ACP脱氢酶等。对脂肪酸ACP脱氢酶的晶体分析表明，此类酶可形成一个双铁活性中心，两个铁原子的结合高度对称，其中I个铁原子和E105和H146的侧链作用；另一个与E105和H146的侧链作用。在晶体结构中，从酶表面到内部有一个深的空穴，该空穴为脂肪酰的结合位(Caboon E B.，J Boil Chem,1994. 269:27519-526)。硬脂酸(C18:0)去饱和产生油酸，一般认为该反应由A 9-硬脂酰ACP脱氢酶在质体的基质中催化完成，然后以脂形式存在的油酸被转运到类囊体膜或进入细胞质中进一步去饱和。研究表明，硬脂酸△ 9脂肪酸脱氢酶广泛存在于油籽植物中，其表达受到生长环境中营养物和其它环境因素的影响(V. M. McDonough, J. E. Stukey, et al. JBoil Chem, 1992. 267: 5931-5936)。由于A 9脂肪酸脱氢酶是第一个向脂肪酸引入双键的酶，其决定了生物体中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量比，在不饱和脂肪酸的合成中起了关键作用。目前，已有多种动物、植物、微生物等不同来源的脂肪酸脱氢酶基因的同源序列被分离获得，有些推定的脂肪酸脱氢酶基因已证明具有相应的酶功能。研究A9脂肪酸脱氢酶的表达、生理功能和应用是当前的热点之一(Luo Tong et al. ,2006. BiotechnologyLetters 28，657-662)。同时，作为天然A 9脂肪酸脱氢酶蛋白，其稳定性、底物亲合性等酶学性质均有待进一步提高。更重要的是高油含量的植物中含有的△ 9脂肪酸脱氢酶，如麻疯树△ 9脂肪酸脱氢酶，能否在异源真核细胞如酵母中生产不饱和脂肪酸并用于酵母发酵生产油脂仍是一个有待解决的问题。利用分子进化的手段对天然的麻疯树A9脂肪酸脱氢酶。因此，利用分子进化的手段对△ 9脂肪酸脱氢酶分子进行改造，改善其酶学性质，就显得越发重要。定向进化属于蛋白质的非理性设计，不需事先了解蛋白质的结构、活性位点以及催化机制等，而是通过模拟自然进化机制，在体外对酶基因进行广泛的突变，产生基因多样性，再结合定向筛选，获得具有某些预期特征的进化酶。易错PCR以其操作简便、有效等优点成为目前应用最为广泛的进化手段之一。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，通过致错PCR技术获得一种比麻疯树的野生型A 9脂肪酸脱氢酶进一步提高不饱和脂肪酸产量的突变基因，并提供编码这一突变基因的核苷酸或其核苷酸序列的片段、类似物或者衍生物。本专利技术进一步所要解决的技术问题是提供该基因所编码的A9脂肪酸脱氢酶突变体多肽、或其片段、类似物或衍生物。本专利技术更进一步所要解决的技术问题是提供含有该基因核苷酸序列可进行功能性表达的重组质粒。本专利技术更进一步所要解决的技术问题是提供该基因核苷酸序列或包含该基因核苷酸序列的重组质粒转化或转导的真核宿主细胞及其后代。本专利技术更进一步所要解决的技术问题是提供一种用含有该基因核苷酸序列、或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组质粒转化或转导的宿主细胞及其后代细胞，提高相应不饱和脂肪酸产量的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案 首先，本专利技术提供一种通过致错PCR技术获得的编码麻疯树A 9脂肪酸脱氢酶突变体的基因，该基因具有序列表中SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。其次，本专利技术还提供由上述核苷酸序列所编码的麻疯树A9脂肪酸脱氢酶突变体，该突变体具有上述的核苷酸序列编码的氨基酸序列，即序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。所述氨基酸序列是与野生型麻疯树A9脂肪酸脱氢酶相比含有缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的突变体氨基酸序列，而且该序列具有提高的△ 9脂肪酸脱氢酶的活性。第三方面，本专利技术也提供含有上述编码A9脂肪酸脱氢酶突变体的核苷酸序列，可进行功能性表达的重组质粒。在本专利技术的实施例中，该重组表达载体是上述的核苷酸序列连接异源启动子而成的重组pYES2/CT/Jc A 9mut质粒。第四方面，本专利技术还提供被上述核苷酸序列或包含上述核苷酸序列的重组质粒转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。它是细菌细胞、或真菌细胞、或植物细胞、或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。特别是酿酒酵母细胞。、第五方面，本专利技术还涉及一种上述突变体、突变基因、宿主细胞在生产不饱和脂肪酸中的应用。提供一种用含有上述核苷酸序列、或上述核苷酸序列与异源调节序列连接的重组质粒转化或转导的宿主细胞及其后代细胞，提高相应不饱和脂肪酸产量的方法。在本专利技术的一个实施例中，上述含有重组质粒的酿酒酵母细胞的A9不饱和脂肪酸产量得到显著提升。、、本专利技术的有益效果如下本专利技术通过易错PCR技术对麻疯树A9脂肪酸脱氢酶进行体外定向进化，获得的突变酶可以大幅提高不饱和脂肪酸含量。附图说明图IA为本专利技术实施例中所用的酵母表达载体PYES2/CT的模式图。图IB为本专利技术麻疯树A 9脂肪酸脱氢酶突变基因重组表达质粒(或载体)pYES2/CT/Jc A 9mut的模式图。图2为本专利技术实施例中的麻疯树△ 9脂肪酸脱氢酶突变体在酿酒酵母中表达的免疫印记图。图3为本专利技术实施例中在酿酒酵母中表达的麻疯树△ 9脂肪酸脱氢酶突变体蛋白经质谱鉴定的多肽片段(阴影部分)。图4A及图4B为本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种编码麻疯树Λ9脂肪酸脱氢酶突变体的基因，其特征在于，该基因具有序列表中SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。2.ー种麻疯树△ 9脂肪酸脱氢酶突变体，其特征在干，该突变体具有权利要求I所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列，即序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。3.如权利要求2所述的麻疯树△9脂肪酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述氨基酸序列是与野生型麻疯树△ 9脂肪酸脱氢酶相比含有缺失、替换或插入ー个或多个氨基酸后的突变体氨基酸序列，而且该序列具有提高的△ 9脂肪酸脱氢酶的活性。4.一种表...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭欣，
申请(专利权)人：嘉汉林业广州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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