一种海藻糖合酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种海藻糖合酶及其编码基因与应用。海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术首次由施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)中获得海藻糖合酶，该海藻糖合酶制备方法简便，产量大，纯度高；实验证实其热稳定性好，反应1h海藻糖转化率即可达到70％，较现有的海藻糖合酶反应时间大大缩短，可以降低海藻糖的生产成本，为海藻糖的工业化生产奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种海藻糖合酶及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种海藻糖合酶及其编码基因与应用，属于生物

技术介绍
海藻糖(Trehalose)是一种由两个吡喃环葡萄糖分子经α-1,1-糖苷键连接构成的非还原性二糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。研究表明，其性质稳定，对生物体具有非常重要的生物学意义。主要表现在它是生物体能源和碳源的储备物，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳定剂和保护剂，是信号传感复合物和生长调控因子，而且还是某些细菌细胞壁的组分之一，因此在科学界海藻糖有“生命之糖”的美誉。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料。因此海藻糖可广泛的应用到医药、化妆品业以及食品行业，具有诱人的开发应用前景和巨大的经济效益。鉴于海藻糖广泛而重要的应用价值，寻找海藻糖高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。目前海藻糖的生产方法主要有酵母提取法、发酵法、酶合成法。其中酶法生产海藻糖具有较高的特异性和快速温和等特点，已经成为研发海藻糖工业化生产的热点并作为短期可见效的可行性途径之一。海藻糖合酶(EC5.4.99.16,Trehalosesynthase,TreS)是一种分子内葡糖苷转移酶它只需要一步反应就可以将麦芽糖的α-1,4糖苷键转化为α-1,1糖苷键生成海藻糖。该酶反应流程短，易调控，不需要消耗高能物质，不需要磷酸盐共存，只需要一种酶一步反应就能获得海藻糖，因此海藻糖合酶转化法是适宜工业化生产海藻糖的方法，有着良好的应用前景，受到广泛的关注。到目前为止，国内外有报道的能够产海藻糖合酶的微生物已经超过15种。不同微生物来源的海藻糖合酶的催化效率、酶学性质各有不同，但具有基本共同点：一是底物转化率较低，最高只有80％左右，一般为60％-70％；二是酶的热稳定性较差，最适反应温度为25℃左右；三是反应时间太长，一般为48小时，有的长达72h。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种热稳定性好，反应时间大大缩短的来源于施氏假单胞菌(PseudomonasstutzeriQlu3)的海藻糖合酶及其表达基因与应用。本专利技术技术方案如下：一种海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。一种海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术所述海藻糖合酶是通过大肠杆菌原核高效表达后，利用亲和层析，离子交换层析，分子筛层析等一系列纯化手段，最终获得。该海藻糖合酶与文献报道的施氏假单胞菌(PseudomonasstutzeriCJ38)海藻糖合酶氨基酸序列同源性为98％，但是其反应时间大大缩短而且热稳定性良好。上述重组蛋白反应1h即可达到反应平衡点，海藻糖转化率为70％。上述重组蛋白在50℃金属浴中放置30min海藻糖转化率依然可以达到50％。上述重组蛋白最适反应温度为35℃。上述重组蛋白最适反应pH为8.0。一种插入上述SEQIDNo.1所示核苷酸序列的重组载体。一种转基因细胞系，含有上述重组载体。上述海藻糖合酶的表达基因、重组载体或转基因细胞系在制备海藻糖合酶中的应用。上述海藻糖合酶在制备海藻糖中的应用。本专利技术所述的海藻糖合酶，由施氏假单胞菌(PseudomonasstutzeriQlu3)中获得，具体方法为：利用简并引物从施氏假单胞菌(PseudomonasstutzeriQlu3)基因组中扩增获得海藻糖合酶的全长基因。将该基因连接到pET-15b载体上构建成质粒，并转化到大肠杆菌BL21DE(3)中进行原核表达。然后通过镍柱亲和层析，Source-Q离子交换层析，Superdex-200分子筛层析的方法分离获得高纯度的海藻糖合酶。有益效果本专利技术首次由施氏假单胞菌(PseudomonasstutzeriQlu3)中获得海藻糖合酶，该海藻糖合酶制备方法简便，产量大，纯度高；实验证实其热稳定性好，反应1h海藻糖转化率即可达到70％，较现有的海藻糖合酶反应时间大大缩短，可以降低海藻糖的生产成本，为海藻糖的工业化生产奠定了基础。附图说明图1是PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果照片；图中：M、Marker，T为海藻糖合酶的目的条带。图2为分子筛纯化后海藻糖合酶SDS-PAGE电泳图结果照片；图中：M为Marker；B11，B12，C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7为分子筛纯化后不同收集管收集到的样品；图3为通过高效液相测定的葡萄糖、麦芽糖和海藻糖的标样峰状结果图；图4为通过高效液相测定反应结束后葡萄糖、海藻糖和麦芽糖的峰状结果图；图5为纯化后海藻糖合酶反应时间对转化率影响的曲线图；图6为文章报道的海藻糖合酶反应时间对转化率影响的曲线图；图7为纯化后海藻糖合酶酶活最适反应温度曲线及酶活温度稳定曲线图；其中，图7A为纯化后海藻糖合酶酶活的最适反应温度曲线；图7B为纯化后海藻糖合酶酶活温度稳定曲线；图8为纯化后海藻糖合酶最适反应pH曲线及pH稳定曲线图；其中，图8A为纯化后海藻糖合酶酶活最适反应pH曲线；图8B为纯化后海藻糖合酶酶活pH稳定曲线。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步阐述，但本专利技术所保护范围不限于此。实施例1：克隆得到施氏假单胞菌(PseudomonasstutzeriQlu3)海藻糖合酶基因依据NCBI上公开的施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)海藻糖合酶全长核苷酸序列设计简并引物，引物序列如下：上游引物：5’-atcggatccatgagcahnccagacaahanctatatc-3’；下游引物：5’-tcactcgagttarancaccgghgr-3’；以施氏假单胞菌(PseudomonasstutzeriQlu3)的基因组为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：上述PCR反应按照如下程序进行：95℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸4min，28个循环；72℃终延伸10min。PCR结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用博大泰克的DNA纯化试剂盒进行回收切胶产物。实施例2：将海藻糖合酶基因转化到表达宿主中，获得阳性表达菌株。PCR产物及质粒载体的双酶切反应PCR产物的酶切体系：反应条件：37℃反应2～3h。质粒载体的酶切体系：反应条件：37℃反应6～8h。PCR产物和载体双酶切后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收。连接反应体系：充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，16℃连接过夜，制得连接产物。重组质粒的转化(1)感受态细胞的制备①挑取BL21单菌落(或挑取保存菌种)接种至10ml液体LB培养基中，37℃，210rpm过夜培养；②取5ml菌液接种于500mlLB培养基中，37℃，210rpm，摇70～80min本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种插入权利要求1中SEQIDNo.1所示核苷酸序列的重组载体。4.一种转基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏静，王瑞明，李珍珍，张云霄，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37