工业化的基因合成方法技术

本发明专利技术揭示了一种工业化的基因合成方法，包括以下步骤：（1）将待合成的DNA序列进行分析和优化，得到目标DNA序列；（2）根据目标DNA序列，设计用于延伸的寡核苷酸链；（3）合成并纯化寡核苷酸链；（4）拼接寡核苷酸链，形成DNA片段；（5）将DNA片段克隆至载体得到重组体质粒；（6）对重组体质粒进行测序分析；（7）对测序正确的重组体质粒进行质量验证。本发明专利技术具有高成功率、高通量、高速度、低成本的特点，并且设计简单、适用面广、操作标准化、可以进行工业化规模推广，有利于降低成本、缩短合成周期和提高合成质量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及遗传工程领域，尤其涉及一种适合工业化生产的基因合成方法。
技术介绍
作为分子生物学操作的基础技术之一，分子克隆已经成功运用二十余年，是科学家们进行基因克隆、检测、功能研究和重组表达的必要手段，对生物工程的发展起到了革命性的推动作用。在基因时代高速发展的今天，传统的分子克隆技术已不能满足科研人员所需要的高效准确的基因操作要求，而基因合成技术的出现正填补了这个空缺，成为目标基因获取的重要技术手段。利用基因合成的方式获得目的基因，不但能够获得自然界中不存在或者模板含量极低的基因序列，而且可以通过序列优化提高表达量或者达到基因功能修饰的目的。基因合成技术为人类改造生物开辟了一个全新的方向，任何与基因相联系的领域都需要进行人工基因的合成，并利用质粒或者病毒等载体运送到目的细胞或组织，以达到各种目的。随着蛋白质组学的发展，生物制药等行业的研究的不断深入，全基因合成的需求也在日益增加。在可预计的将来，基因合成将在生命科学以及新能源、新材料、人工生命、核酸疫苗、生物医药等领域中发挥巨大作用。基因合成有两种途径，一是基因合成公司的商业合成，二是本地实验室自己合成基因。实验室自己合成基因一般需要参考学术文章，根据参考文献的方法进行合成，但大多都只是个别基因的合成，并且成本高、成功率低，因此只具备有限的参考价值。而基因合成公司的商业合成则是有专业技术人员操作，并且具有合成周期短，可对基因的酶切位点或基因序列进行修改，可以进行密码子优化，也可根据研究人员自己的意愿设计得到自然界中很难获得甚至不存在的基因等优势，所以决定了基因合成公司的商业合成成为目前基因合成的主要渠道。目前基因合成主要包括三个步骤一是化学法合成寡核苷酸片段，通常合成的寡核苷酸片段在150bp 200bp ；二是用酶法将化学合成的寡核苷酸链进行人工拼接，得到较长的序列；三是以较长的序列为基础，进一步拼接得到更长的DNA序列，直到达到需要的长度。在基因人工合成中，寡核苷酸链的拼接是基因人工合成的主要限速步骤。常用的基因拼接方法主要有以下二种第一种方法是连接酶法，是先将寡核苷酸激活，带上必要的5 ‘-磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，再用连接酶(T4 DNAS Ligase, Taq Ligase等)将它们彼此连接成一个完整的基因或基因的一个大片段 (Khorana HG. Science. V203, 614-625. 1979)。由于所有的连接酶都需要5‘-磷酸化的末端和3' _羟基进行连接，所以在反应前，用于连接的中间引物需要进行5'-磷酸化处理，这就使得基因合成的成本大大增加。同时，为了保证合成的效率，单次连接酶反应合成较长序列的长度受到限制，通常不宜超过500bp。第二种方法是PCR法，将两条具有互补3'-末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段，可经处理插入适当的载体上。PCR法通常还被用于更长序列的合成，如 Smith 等人(Hamilton 0. Smith, ClydeA. Hutchison III, Cynthia Pfannkoch et al .PNAS. V100, 15440-15445. 2003)用Tag Ligase对引物进行连接后，再对连接产物进行 PCR法合成，得到了全长的5386bp的ΦΧ174 bacteriophage基因组。PCR法不需要对寡核苷酸链进行任何修饰，因此合成成本较连接酶法大大降低，但是由于多条寡核苷酸链并行反应，要合成的序列越长，则发生错误延伸的可能性就越大。等温单向生长的基 因合成方法 (专利号ZL 200610028886. 6)是一种PCR方法的改良，在DNA寡核苷酸链设计时加入了发夹结构和酶切位点，在同一反应体系中加入多种酶包括聚合酶、外切酶和限制性内切酶，使得多个DNA寡核苷酸链在同一条件下等温单向生长，之后在三种酶的作用下互补杂交、再进行下一轮的聚合延伸。该种方法采用多个DNA寡核苷酸链在同一条件下反应简化了操作， 降低了成本，但是却存在诸多缺点，如寡核苷酸链设计复杂，多种酶同时进行多步反应导致拼接效率低，长DNA序列合成的成功率低以及基因合成的产量小，无法直接用于下游操作， 如克隆、连接反应等都要再进行PCR扩增等，因此无法用于较长基因、全基因或基因组的合成，更难在实际生产中推广。
技术实现思路
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提出一种具有高成功率、高通量、 高速度和低成本的工业化基因合成的方法。本专利技术的目的将通过以下技术方案得以实现 一种，其特征在于包括以下步骤步骤一将待合成的DNA序列进行分析和优化，得到与设计相一致的目标DNA序列； 步骤二 根据步骤一中所述目标DNA序列，设计用于延伸的寡核苷酸链； 步骤三合成并纯化步骤二中设计的所述寡核苷酸链； 步骤四将步骤三中得到的所述寡核苷酸链进行拼接，形成DNA片段； 步骤五将步骤四中得到的所述DNA片段克隆至载体得到所述目标DNA序列与载体的重组体质粒；步骤六对所述重组体质粒进行测序分析； 步骤七对测序正确的所述重组体质粒进行质量验证。进一步的，上述的，其中所述步骤二中设计用于延伸的寡核苷酸链的步骤为一、将所述目标DNA序列记为正链，正链的互补链记为负链，分段成首尾相连的DNA片段；二、将每段DNA片段又分成多个寡核苷酸链，每个寡核苷酸链与其左右相邻的寡核苷酸链具有首尾重叠互补序列，从所述DNA片段的5'-端开始将寡核苷酸链按顺序编号，其中奇数的寡核苷酸链为正链，偶数的寡核苷酸链为负链，所述DNA片段中的寡核苷酸链的数量都为偶数；三、所述目标DNA序列的5‘-端第一个DNA片段的最后一个编号的寡核苷酸链的 5'-端和与其相邻的第二个DNA片段的第一个编号的寡核苷酸链的5'-端具有重叠互补序列，依次类推，每两个相邻DNA片段之间都有重叠互补序列；四、在位于目标DNA序列最5'-端的寡核苷酸链的5'-端添加一段与载体上目标 DNA序列插入位点的上游序列重叠的序列；五、在位于目标DNA序列最3'-端的寡核苷酸链的5'-端添加一段与载体上目标 DNA序列插入位点的下游序列重叠互补的序列。 进一步的，上述的，其中每段DNA片段的长度在20个 20000个碱基对之间；每个寡核苷酸链的长度在20个 500个碱基之间；每个寡核苷酸链与其相邻的寡核苷酸链之间的重叠互补序列的长度在10个 50个碱基之间。进一步的，上述的，其中添加的所述重叠序列和所述重叠互补序列分别为长度在ο 100个碱基之间的DNA序列。进一步的，上述的，其中所述寡核苷酸链的退火温度在 30°C 70°C之间。进一步的，上述的，其中所述步骤三中合成寡核苷酸链的方法为磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化法和基因芯片法中的任意一种。进一步的，上述的，其中所述固相亚磷酰胺三酯法是将所要合成的寡核苷酸链的3'-末端先以3' -OH与一个固相载体连接，然后依次从3' -5' 的方向将保护了活性官能团的核苷酸单体加上去，最后形成以3' ,5'-磷酸二酯键连接起来的寡核苷酸片段。进一步的，上述的，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种工业化的基因合成方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：将待合成的ＤＮＡ序列进行分析和优化，得到与设计相一致的目标ＤＮＡ序列；步骤二：根据步骤一中所述目标ＤＮＡ序列，设计用于延伸的寡核苷酸链；步骤三：合成并纯化步骤二中设计的所述寡核苷酸链；步骤四：将步骤三中得到的所述寡核苷酸链进行拼接，形成ＤＮＡ片段；步骤五：将步骤四中得到的所述ＤＮＡ片段克隆至载体得到所述目标ＤＮＡ序列与载体的重组体质粒；步骤六：对所述重组体质粒进行测序分析；步骤七：对测序正确的所述重组体质粒进行质量验证。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：柳伟强，杨平，刁文一，张万方，孙中平，廖国娟，
申请(专利权)人：苏州金唯智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32