UNG-dUTP防产物污染系统在全血PCR反应体系的应用，本发明专利技术描述了UNG、dUTP等组分可以加入全血PCR反应体系内，起防PCR产物气溶胶污染的作用。UNG-dUTP防污染系统和全血PCR体系的结合，使全血PCR体系具有更广泛的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物技术中的PCR扩增
，尤其涉及UNG-dUTP防产物污染系统在全血PCR反应体系的应用。
技术介绍
PCR (Polymerase Chain Reaction)，即聚合酶链式反应，是一种体外扩增DNA片段的技术。1985年，美国科学家Kary Mullis专利技术了 PCR技术。采用PCR扩增方法，在反应体系中即使只有一个拷贝DNA片段，在经过变性退火延伸等温度变化循环之后，就能扩增出大量拷贝数的特异性DNA片段。该方法广泛应用于生命科学研究与临床基因检测。PCR的原理是在体外缓冲体系内模仿细胞内发生的DNA复制过程，以DNA互补链聚合反应为基础，通过目的模板DNA变性、引物与模板DNA的互补配对序列退火复性以及耐热性DNA聚合酶催化引物延伸反应等过程的多次循环，产生特异性扩增的DNA片段。经过多循环的扩增后，特异性DNA片段的量达到检测灵敏度的要求，便于进行后续的凝胶电泳或者荧光定量分析。由于PCR具有非常高的扩增效率和灵敏度，极其微量的DNA污染便可造成假阳性的结果。污染的主要原因有以下两种情况(1)样本间交叉污染样本污染主要发生原因为收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，而造成交叉污染；另外，样本在核酸的提取过程中，由于移液器操作不当引起样本间交叉污染；(2) PCR扩增产物污染PCR产物是PCR反应中最为常见的污染来源，PCR产物的拷贝数量非常大，一般为 IO13拷贝/ml，极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性结果.造成PCR产物污染的形式最可能是气溶胶污染，PCR反应体系在反应管开盖、摇动、快速吸样、反复吹吸等操作时与空气接触都可很容易形成气溶胶，据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，可见微量的气溶胶污染即可引起假阳性结果.而且气溶胶可在试剂配制过程中污染PCR试剂，造成严重的产物污染现象。目前，在临床上常见的检测样本是人外周静脉血液，无论是对血液中基因组DNA 进行提取然后进行PCR还是使用全血为模板直接进行PCR反应，均存在PCR产物气溶胶污染的问题。UNG-dUTP系统是在PCR污染引起假阳性结果的问题出现不久便被专利技术的用于防产物污染的方法，并在美国申请了专利(US 5536649)。该方法具有可彻底消除污染源的优点，UNG (Uracil-DNA Glycosylase,尿嘧啶DNA糖基化酶)处理可以和PCR在同一个反应管内进行，具有简便性。其技术原理是在PCR反应体系内加入dUTP代替dTTP或者按照一定比例同时加入dUTP和dTTP，使PCR反应产物中掺入大量的dUTP(也可以采用含有dUTP的引物进行扩增的方法)，在再次PCR之前用UNG处理PCR反应体系即可消除上一次PCR产物 (dU-DNA)的残留污染。UNG在一定温度条件下，可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，除去上一次PCR产物双链上的dUTP，阻止了 DNA聚合酶对dU-DNA为模板进行延伸，而 UNG对不含dUTP的模板的扩增无任何影响。特别的，UNG在PCR循环中的变性步骤中经高温被灭活，因此也不会影响新一轮PCR产物dU-DNA的生成。专利CN1940087A公开了 UNG_dUTP系统用于血清或血浆标本病毒核酸的测定，文中描述的方法需要先对血液中基因组DNA进行提取然后再将UNG-dUTP系统用于PCR反应， 由于血液中基因组DNA的提取过程比较繁琐，也无法避免样本间交叉污染。该法没有直接用于全血为模板的PCR系统，UNG-dUTP系统仍是应用于提取后的DNA扩增体系。全血模板中存在复杂的组分，含有多种酶类，糖类，脂类，以及各种酶的抑制因子，全血的加入使PCR反应体系环境不同于提取DNA后的反应体系，目前尚无文献报道 UNG-dUTP系统可以适用于全血为模板的PCR体系。
技术实现思路
本专利技术提供一种UNG-dUTP防产物污染系统在全血PCR反应体系的应用，目的是解决现有以全血为模板进行PCR反应体系容易产生PCR产物气溶胶污染的问题。UNG和dUTP 或者UNG和含有dUTP的引物等组分同时直接加入以全血为模板进行PCR反应体系，能够有效的消除了由于PCR产物气溶胶污染导致的假阳性结果。本专利技术通过以下技术方案来达到全血PCR反应体系防产物污染的目的。UNG-dUTP防产物污染系统在全血PCR反应体系中的应用，其特征在于PCR反应体系以全血为模板，包含UNG和dUTP或者UNG和含有dUTP的引物。其中全血模板可以含有柠檬酸钠或EDTA或肝素抗凝剂中的任意一种。全血模板含有含基因组DNA的白细胞或含游离基因组DNA的血清。本专利技术对全血为模板的体系中UNG (尿嘧啶DNA糖基化酶)的活性进行了研究，研究证明UNG的尿嘧啶DNA糖基化酶活性在其活性温度下不受加入的全血模板的影响全血模板体系内加入UNG-dUTP防产物污染系统，在UNG活性温度条件下，UNG能消除上一次PCR 产物上的dUTP，进而阻碍聚合酶对上一次PCR产物的延伸，从而起到消除产物污染的作用， 由于UNG的尿嘧啶DNA糖基化酶活性不受加入的全血模板影响，在后续的循环中，UNG经过高温变性失活，从而不对后续的PCR产物生成影响。本专利技术采用一对非人源引物(该对引物无法扩增人类基因组)扩增人工构建的质粒模板来制备含有dUTP的PCR产物，以该PCR产物为模板进行下一轮PCR反应，下一轮PCR 反应体系内除正常组分外，还包含UNG、dUTP、以及人类血液。经过试验，PCR体系内血液浓度在一定范围内时，UNG能清除上一次PCR产物上的dUTP，阻碍了聚合酶对其的延伸，起清除产物污染的作用。证明UNG的尿嘧啶DNA糖基化酶活性在其活性温度下不受加入的全血模板的影响。本专利技术与现有技术相比具有下列优点和效果本专利技术所述UNG-dUTP防产物污染系统在全血PCR反应体系的应用，相对于目前 UNG-dUTP系统只用于以DNA为模板进行扩增过程的防产物污染而言，扩大了 UNG-dUTP防污染系统的使用范围。使用全血为模板进行PCR，可以大大缩短样本处理时间，减少交叉污染的机会，有效防止产物气溶胶污染。附图说明图1为非人源dU-DNA的PCR电泳图。图2为UNG在含有全血的PCR反应体系的PCR电泳图。下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述。实施例1 UNG-dUTP防产物污染系统在全血PCR反应体系的应用，即尿嘧啶DNA糖基化酶在含有全血的PCR反应体系中具有清除含dUTP产物的活性。包括下列步骤第一步制备非人源的dU-DNA1. 1、采用一对非人源引物对人工质粒pcDNA4/T0 (购自hvitrogen公司，商品目录号V102020)进行扩增获得dU-DNA产物，并以人类基因组DNA和全血为模板检验该对引物的非人源性。该对非人源引物的序列如下，其对质粒PCDNA4/T0的扩增产物的片段大小为 184bp ；上游 iTeton F :5’ -GGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTC-3， 下游 iTeton R 5' -GTGGGTTCTCTAGTTAGCCACCGGAGGCTGGATCGG-3’ 具体操作为将PCR反应缓冲液、上下游引物、4种脱氧核糖核苷酸与dUTP，DNA聚合酶、镁离本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．ＵＮＧ－ｄＵＴＰ防产物污染系统在ＰＣＲ反应体系的应用，其特征在于ＰＣＲ反应体系以全血为模板，包含ＵＮＧ和ｄＵＴＰ或者ＵＮＧ和含有ｄＵＴＰ的引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何晓辉，王进，秦正红，
申请(专利权)人：苏州旷远生物分子技术有限公司，
类型：发明
国别省市：32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。