特发性膜性肾病双联检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及特发性膜性肾病检测试剂盒，a.anti‑PLA2R Ab试纸条，包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体(anti‑lgG4 Ab)的anti‑lgG4金垫，以及含有PLA2R蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜，b.anti‑THSD7A Ab试纸条，包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体(anti‑lgG4 Ab)的anti‑lgG4金垫，以及含有THSD7A蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜，本发明专利技术的双联检测试剂盒通过检测全血/血清/血浆中的anti‑PLA2R Ab和anti‑THSD7A Ab来筛查特发性膜性肾病，具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

【技术实现步骤摘要】
特发性膜性肾病双联检测试剂盒[
]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种特发性膜性肾病检测试剂盒。[
技术介绍
]全世界有超过5亿人患有不同程度的慢性肾脏病，慢性肾脏病已成为继肿瘤、心脑血管病、糖尿病之后，又一威胁人类健康的重要疾病，成为全球性的重要公共卫生问题。在我国，慢性肾脏病的发病率为10％～13％。中国人口众多，慢性肾脏病患者的总数庞大，这无疑已成为我国沉重的社会和经济负担。膜性肾病按发病原因可分为特发性和继发性膜性肾病，其诊断上要依靠临床表现，肾脏穿刺术的组织学检查或肾组织电镜检查。肾脏穿刺术是一种侵入式的诊断方法，对病人有一定的伤害；肾组织电镜检测对设备要求很高，难以普及使用；而血清标志物检测可以为特发性膜性肾病的初筛和病情监测提供辅助作用。因此，开发非创伤、低风险、安全、廉价、精确的快速检测试剂盒有重要意义。检测抗PLA2R(或抗THSD7A)抗体的方法有双抗原夹心法和间接法双抗原夹心免疫层析法：检测时，当样本中含有抗PLA2R(或抗THSD7A)抗体时，将与玻璃纤维上包被的重组人PLA2R蛋白(或重组人THSD7A蛋白)的金标记物结合形成复合物，在层析作用下反应复合物沿着硝酸纤维素膜移动至检测区(T)，被硝酸纤维素膜上检测区(T)内包被的重组人PLA2R蛋白(或重组人THSD7A蛋白)所捕获，在检测区(T)内出现一条紫红色条带。相反，当样本中不含抗PLA2R(或抗THSD7A)抗体时，则检测区(T)内无紫红色条带出现。间接免疫层析法：在玻璃纤维膜上预包被金标鼠抗人lgG4抗体(anti-lgG4Ab)，在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被重组人PLA2R蛋白(或重组人THSD7A)和羊抗鼠二抗。检测阳性样本时，血清样本中PLA2R-Ab(或THSD7A-Ab)与胶体金标记鼠抗人lgG4抗体结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的抗原结合形成“Au-anti-lgG4Ab-PLA2RAb-PLA2RAg”(或Au-anti-lgG4Ab-THSD7AAb-THSD7AAg)夹心物而凝聚显色，游离的鼠抗人lgG4抗体金标记物则在对照线处与羊抗鼠二抗结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色，15分钟内观察结果即可。免疫层析法：一份样品在检测装置的毛细管作用的带动下与标记好检测抗体的可见颗粒(胶体金、乳胶、量子点、荧光微球或酶促反应)流经由捕获抗体时发生免疫反应而形成的可见检测线或者检测斑点。该方法具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。中国专利技术专利CN201610201970.7公开了一种特发性膜性肾病ELISA检测试剂盒及其检测方法，该专利利用直接ELISA法，定量检测人血清中的anti-PLA2R和anti-THSD7A自身抗体来筛查特发性膜性肾病，该方法耗时长(2-3小时)；需要在专业场所，专业人员和设备进行检测；检测费用高，不利于基层大规模筛查特发性模型肾病。[
技术实现思路
]为了解决上述现有技术存在的问题，本专利技术提供一种免疫层析法快速检测血清中anti-PLA2R和anti-THSD7A自身抗体来筛查特发性膜性肾病，该方法检测时间短(10-15min)；无需专业场所，专业人员和设备进行检测；检测费用低，适合基层大规模筛查特发性模型肾病。为了实现上述目的，专利技术一种特发性膜性肾病双联检测试剂盒(间接免疫层析法)，包括：a.anti-PLA2RAb试纸条包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体(anti-lgG4Ab)的anti-lgG4金垫，以及含有PLA2R蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜。b.anti-THSD7AAb试纸条包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体(anti-lgG4Ab)的anti-lgG4金垫，以及含有THSD7A蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。该检测试剂盒还具有如下优化方案：所述的显色标记为以胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、量子点、化学发光或者酶标记物及可通过肉眼或者仪器进行检测的分子或者颗粒物标记鼠抗人lgG4抗体。anti-PLA2RAb试纸条还包括样本垫、金垫、吸水纸、底板。更进一步的，anti-PLA2RAb试纸条的硝酸纤维素膜、样本垫、金垫和吸水纸置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一侧搭接anti-lgG4金垫，anti-lgG4金垫另一侧搭接样本垫，硝酸纤维素膜靠近质控线一侧搭接吸水纸。anti-THSD7AAb试纸条还包括样本垫、金垫、吸水纸、底板。更进一步的，anti-THSD7AAb试纸条的硝酸纤维素膜、样本垫、金垫和吸水纸置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一侧搭接anti-lgG4金垫，anti-lgG4金垫另一侧搭接样本垫，硝酸纤维素膜靠近质控线一侧搭接吸水纸。还包括盒体，盒体上设有加样孔，盒体内设有双联卡槽。本专利技术的双联检测试剂盒通过检测全血/血清/血浆中的anti-PLA2RAb和anti-THSD7AAb来筛查特发性膜性肾病，具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。[附图说明]图1、图2和图3均为特发性膜性肾病阳性时试纸条的显色示意图；图4为特发性膜性肾病阴性时试纸条的显色示意图；图5为需重新测试时试纸条的显色示意图；图6为试纸条的结构示意图。[具体实施方式]以下，结合实施例和附图对于本专利技术做进一步的说明，实施例和附图仅用于解释说明而不用于限定本专利技术的保护范围。制备anti-PLA2RAb和anti-THSD7AAb联合检测筛查特发性膜性肾病的检测卡的工艺如下：1主要材料1.1PLA2R蛋白和THSD7A蛋白制备1.1.1引物设计根据NCBI和相关文献报道，分别对PLA2R(Accession:Q13018)和THSD7A(AccessionNP_056019.1)基因进行引物设计，引物具体序列如下：PLA2RGeneF1如SEQIDNO.1所示，R1如SEQIDNO.2所示。THSD7AGeneF1如SEQIDNO.3所示，R1如SEQIDNO.4所示。1.1.2表达载体构建对PLA2R和THSD7A基因的全长进行扩增，回收纯化，通过快速克隆的方法将基因构建到原核表达载体PET-28a载体上。转化大肠杆菌DH5α,挑克隆、提取质粒并测序鉴定。1.1.3蛋白表达和纯化将构建好的Pet-28a-PLA2R和Pet-28a-THSD7A质粒转化到BL21感受态细胞中，经IPTG诱导获得所需蛋白。使用均质机对菌体进行裂解，并将上述蛋白通过ChelatingSepharoseFF柱进行蛋白纯化，获得其粗蛋白。然后使用pure系统对粗蛋白进行最后阶段的纯化，得到所述的PLA2R蛋白和THSD7A蛋白。1.2其它原料鼠抗人lgG4抗体(名称：Mouseanti-HumanIgG4FcSecondaryAntibody,货号A-10651,厂家thermofisher)；羊抗鼠IgG抗体：Sigma公司产品，用于硝酸纤维素膜质控线或者质控斑点包被；硝酸纤维素膜：MILLIPORE公司产品；样本垫、结合垫、吸水纸、PVC底板和双联卡壳：上海杰一生物技术有限公司2方法2.1鼠抗人lgG4抗体的标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特征在于包括：a.anti‑PLA2R Ab试纸条，包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体的金垫，以及含有PLA2R蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜；b.anti‑THSD7A Ab试纸条，包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体的金垫，以及含有THSD7A蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。

【技术特征摘要】
1.一种特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特征在于包括：a.anti-PLA2RAb试纸条，包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体的金垫，以及含有PLA2R蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜；b.anti-THSD7AAb试纸条，包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体的金垫，以及含有THSD7A蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。2.如权利要求1所述的特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特征在于所述的显色标记为以胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、量子点、化学发光或者酶标记物及可通过肉眼或者仪器进行检测的分子或者颗粒物标记鼠抗人lgG4抗体。3.如权利要求1所述的特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特征在于所述的anti-PLA2RAb试纸条还包括样本垫、金垫、吸水纸、底板。4.如权利要求3所述的特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨万春，张笑人，王伦善，沈晓宝，陈云，
申请(专利权)人：上海埃文生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31