本发明专利技术提供了一种规模化连续生产海藻糖的方法，所述方法如下：(1)PCS细胞支持物固定于5m3机械通风式发酵罐搅拌轴上形成反应器；(2)接种大肠杆菌基因工程菌于反应器，培养得到产海藻糖酶细胞固定于PCS细胞支持物上即为固定化细胞生物反应器；(3)添加1.0g/L～1.5g/L硫酸粘杆菌素改变固定化细胞通透性，以及25％麦芽糖营养液，经由固定化细胞生物反应器发酵得到高产量的海藻糖。本发明专利技术立足于中试发酵水平，实现了低成本、短周期、高转化的连续操作，具有很强的社会竞争力和经济意义，为大规模生产海藻糖提供较为切实可行的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于发酵工程领域。
技术介绍
海藻糖是一种非还原性二糖，在高温、高寒、高渗透压以及严重失水的恶劣环境下能起到稳定细胞膜和蛋白质的结构，有效地保护细胞，从而维持生物体的生命过程和生物特征，因此海藻糖被称为“生命之糖”。海藻糖不单单具有蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良保护剂的独特功能，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，同时可防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质。目前海藻糖广泛应用于食品、农业、医药等领域。海藻糖工业化生产过程中多为酶法合成，酶法合成过程中游离酶具有不能回收、利用率低、难于分离纯化、使用成本高等缺点；固定化酶可以解决酶反复利用问题，但是因为海藻糖合酶属于胞内酶，必须要破碎菌体细胞，提取和纯化过程加大了生产成本。利用透性化处理含海藻糖合酶细胞产海藻糖已经是一种成熟的技术，省去了提取和纯化酶的过程，但是不能实现工业化连续化生成，导致设备利用率低、生产周期过长。《采用可视化方法通透性处理大肠杆菌细胞生产海藻糖合成酶》(崔怀言等，2014)详述了利用硫酸粘杆素处理细胞，转化率在65%左右，但该技术目前只应用在实验室水平上，未见其规模化生产。专利CN103146779 B公开了一种利用表面活性剂通透性处理重组大肠杆菌细胞合成海藻糖的方法，但细胞需要通过离心处理工序，增加了生产成本，同时细胞没有固定化，不能连续生产，实验工艺无法突破小试阶段。《Evaluat1n of succinic acidcontinuous and repeat—batch b1film fermentat1n by Actinobacillus succinogenesusing plastic composite support b1reactors)) (Susan E.Urbanced等，2004)介绍了发酵罐中PCS细胞支持物固定细胞发酵生产，但对于不同的产物有不同的工艺方法，文中并没有涉及。目前利用固定化细胞生物反应器通透性处理细胞的研究未报道。
技术实现思路
针对现有的规模化海藻糖生产工艺不足，本专利技术所要解决技术问题是提供一种全新的规模化生产海藻糖技术，既能通透性处理细胞，解决生产过程中海藻糖转化率低的问题，又能运用固定化细胞反应器连续生产，降低染菌机率和副产物生成，提高设备利用率，实现规模化连续生产海藻糖，进一步降低海藻糖的生产成本。本专利技术的技术方案为:—种规模化连续生产海藻糖的方法，将产海藻糖合酶的大肠杆菌基因工程菌接种于固定载量的生物反应器，快速富集后经过硫酸粘杆菌素透性化处理，得到含酶通透性细胞，添加底物麦芽糖，连续催化反应得到富含海藻糖的液体，其特征在于:利用固定化细胞生物反应器和硫酸粘杆菌素透性处理实现规模化连续生产。本专利技术所述的方法，实施过程的步骤为:(I)采用划线法将大肠杆菌基因工程菌接种于种子培养基的茄形瓶中培养，培养条件为35°C，20h ；(2)将步骤(I)中的菌苔均配成菌悬液，合瓶收集，接种反应器中发酵培养，发酵条件为350C，200rpm，0.04MPa?0.06MPa，测OD60-为0.8?1.0时向发酵液中添加IPTG至终浓度0.8mmoT,/I,?1.2mmoL/L，诱导酶8h ；(3)在步骤(2)的发酵液中添加1.0g/L?1.5g/L硫酸粘杆菌素处理Ih?2h，终止发酵，将发酵液压出；(4)向固定化细胞反应器中添加麦芽糖营养液进行催化，催化条件为25°C，120rpm ?150rpm，催化时间 20h ；(5)将步骤(4)中反应液压出进行分离干燥即得到海藻糖晶体，继续向固定化细胞生物反应器添加麦芽糖营养液，重复操作。本专利技术所述的方法中，大肠杆菌细胞包含来源于灰产色链霉菌Streptomycesgriseochromogenes的海藻糖合酶基因，并能表达合成海藻糖合酶。本专利技术所述的方法中，种子培养基:蛋白胨10g/L，酵母浸膏4g/L，NaCl 8g/L，氨苄抗生素0.8g/L，琼脂20g/L。本专利技术所述的方法中，反应器是将6或8对PCS细胞支持物固定于5m3机械通风式发酵罐搅拌轴上而形成的，PCS细胞支持物组成(W/W):50%聚丙烯材料，35%大豆饼粉，5%血清蛋白，2.5%大豆粉，2.5%酵母抽提物，2.5%血红蛋白细胞和2.5%蛋白胨，经过高温处理，使用Brabender PL2000制备而成。本专利技术所述的方法中，发酵培养基:玉米浆30g/L?100g/L，葡萄糖20g/L?50g/L，硫酸铵 30g/L ?50g/L，蛋白胨 4g/L ?20g/L，KH2P045g/L ?10g/L，MgSO4.7H201g/L ?5g/L，氨苄抗生素 0.lg/L，pH6.5 ?7.2。本专利技术所述的方法中，麦芽糖营养液:25%麦芽糖，50mmol/L pH8.0磷酸盐缓冲液。本专利技术的实质性的特点体现为:大肠杆菌细胞通透性改变是实现海藻糖合成效率增加的最直接原因。本专利技术的实质性的特点还体现为:运用了固定化细胞生物反应器，从而有效地实现了细胞连续性生产，提高转化率，减少了提取环节，节约了能耗和降低成本。本专利技术的有益效果在于:(I)本专利技术利用固定化细胞生物反应器富集大肠杆菌细胞，获得足量生长旺盛期的细胞，此阶段胞内海藻糖合酶催化活性最高；(2)本专利技术使用固定化细胞反应器连续合成海藻糖，经透性化处理的细胞固定于反应器中，保持酶催化活性最高，在20°C?25°C反应15h?20h即可达到65%以上，催化效率高于现有规模生产技术；(3)本专利技术利用5m3固定化细胞反应器连续生产和细胞通透性处理，与其他固定化酶技术相比，大大缩短了生产周期，提高了设备利用率，更适合于工业化大生产。【具体实施方式】下面结合具体实例对本专利技术进行详细说明:菌种来源大肠杆菌细胞包含来源于灰产色链霉菌Streptomyces griseochromogenes的海藻糖合酶基因，并能表达合成海藻糖合酶。其中菌种构建方式采用专利CN201210160403所述方法。设备原理说明反应器是在5m3机械通风式发酵罐基础上在搅拌轴上固定6或8对PCS细胞支持物所构成，PCS细胞支持物组成(W/W):50%聚丙烯材料，35%大豆饼粉，5%血清蛋白，2.5%大豆粉，2.5%酵母抽提物，2.5%血红蛋白细胞和2.5%蛋白胨，经过高温处理，使用Brabender PL2000 制备而成。检测方法:海藻糖含量检测方法按GB/T23529-2009，海藻糖国标中的高效液相色谱法检测；转化率为终产物海藻糖的终产量与底物麦芽糖含量的比值，转化率的水平高低直接反映产生海藻糖的效果。实施例1本实例说明了的步骤和效果:(I)采用划线法将大肠杆菌基因工程菌接种于10个250mL含有种子培养基的茄形瓶中培养，培养条件为35°C，20h。其中种子培养基:蛋白胨10g/L，酵母浸膏4g/L，NaCl8g/L，氨苄抗生素0.8g/L当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种规模化连续生产海藻糖的方法，依次包括以下步骤：(1)将大肠杆菌基因工程菌接种于种子培养基的茄形瓶中培养，培养条件为35℃，20h；(2)将步骤(1)中培养好的菌苔均配成菌恳液，合瓶收集，接种反应器中培养，培养条件为35℃，200rpm，0.04MPa～0.06MPa，测得OD600为0.8～1.0时向发酵液中添加终浓度0.8mmoL/L～1.2mmoL/L IPTG，诱导酶8h；(3)在步骤(2)的发酵液中添加1.0g/L～1.5g/L硫酸粘杆菌素处理1h～2h，终止发酵，用空气将发酵液压出；(4)向固定化细胞反应器中添加麦芽糖营养液进行催化，催化条件为25℃，120rpm～150rpm，催化时间20h；(5)将步骤(4)中反应液压出进行分离干燥即得到海藻糖产品，继续向固定化细胞生物反应器添加麦芽糖营养液，重复操作。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘建龙，刘原，秦韦子，
申请(专利权)人：山东师范大学，济南博联生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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