应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法技术

本发明专利技术公开了应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，包括以下步骤：将眼镜蛇毒预处理后，通过NGF‑多克隆抗体亲和柱进行吸附、洗脱和进一步纯化，得到眼镜蛇毒神经生长因子；所述NGF‑多克隆抗体亲和柱为：通过眼镜蛇毒NGF基因原核表达，纯化分离得到重组眼镜蛇毒NGF；将重组眼镜蛇毒NGF作为免疫原，免疫动物得到抗血清，并分离纯化得到NGF多克隆抗体；将NGF多克隆抗体与载体结合交联所得。利用基因重组技术，使用产量较高的重组神经生长因子，激发动物产生能蛇毒NGF的多克隆抗体，进而规模化制备NGF‑多克隆抗体亲和柱，利用免疫亲和的特异性及高效性；对天然蛇毒神经生长因子纯化，得到天然的、高活性的蛇毒神经因子。减少生产成本，适应规模化生产。

Method for purifying cobra venom nerve growth factor by using polyclonal antibody affinity column

The invention discloses a method for using polyclonal antibody purified cobra venom nerve growth factor affinity column, which comprises the following steps: Cobra Venom after pretreatment by NGF polyclonal antibody affinity column adsorption, elution and further purified by cobra venom nerve growth factor; the NGF polyclonal antibody affinity column: the cobra venom NGF gene prokaryotic expression, purification of recombinant NGF from Naja naja atra Venom; recombinant NGF as immunogen, immune animal antiserum, and purified NGF polyclonal antibody; NGF polyclonal antibody combined with carrier cross-linked. The use of recombinant DNA technology, the use of high yield recombinant nerve growth factor, can stimulate animal produce polyclonal antibody of NGF from snake venom, and large-scale preparation of NGF polyclonal antibody by immuno affinity column, specificity and efficiency of purification by affinity; natural venom nerve growth factor, nerve activity of natural high and. Reduce production costs, and adapt to large-scale production.

【技术实现步骤摘要】
应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法
本专利技术属于生物化学领域，具体涉及应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法。
技术介绍
神经生长因子(Nevergrowthfactor,NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一，是一种可由多种细胞产生的能促进神经修复的多肽类因子。它与周围神经和中枢神经的存活及发育密切相关,在神经系统、内分泌系统和免疫系统的网络调控中起重要的作用。NGF生物学功能的实现是通过NGF与效应细胞表面的NGF受体结合而介导。它能够维持并促进外周及中枢神经系统中部分神经元的发育和分化，营养成熟的神经元，维持其存活及正常的生理功能，并且在它们受到损伤后，促进其修复和再生。它在外周神经系统的病变及一些神经元退行性疾病，例如早老年性痴呆症、帕金森症的治疗方面显示了良好的应用前景。蛇毒是分离NGF的最初来源之一,1956年Cohen和Levi-Montalcini研究干燥的噬鱼蝮蛇毒中发现具有磷酸二酯酶活性,粗蛇毒与肉瘤匀浆同样能促进脊髓神经节的生长。后来,从蛇毒中发现了NGF，蛇毒NGF常常重组同质多聚体或单体形式,与其它已知的NGF有类似的结构和生物学活性。眼镜蛇毒神经生长因子作为药物的主要活性成分，疗效好、起效快、毒副作用小，是预防和治疗神经系统疾病的理想药物。现在眼镜蛇毒NGF作为药物的难点包括天然分离纯化步骤繁多且NGF纯度达不到临床用药要求。现有的眼镜蛇毒NGF分离纯化主要采用凝胶柱层析法与离子交换层析法的组合，不仅柱效的影响因素繁多，很难加以控制、重复性差，而且纯化步骤较多、得到的NGF的活性较低，纯度一般在90％以下。现有报道也有用单克隆抗体进行免疫柱层析进行分离纯化，即使该方法纯化得到的NGF纯度能达到要求但该方法的弊端是单克隆抗体制作成本高，程序复杂且抗体制备量少、周期长。虽然基因重组的技术使眼镜蛇毒NGF的来源更为方便和广泛，但是重组型的神经生长因子只能复制蛇毒神经因子的一级结构，在立体结构上与天然神经生长因子存在较大差异。而蛋白质在发挥活性是通过空间结构与受体之间的结合，因此造成了重组型的神经生长因子的活性较差,达不到临床用药要求。本专利技术利用基因重组技术，使用产量较高的重组神经生长因子，激发动物产生能有效吸附天然蛇毒NGF的多克隆抗体，进而利用免疫亲和的特异性及高效性；对天然蛇毒神经生长因子纯化，得到高纯度、高活性的蛇毒神经因子。减少纯化步骤和过程，减少生产成本，适应规模化生产。目前，尚未有相关的文献和报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，能够得到天然的、高活性的蛇毒神经因子，减少纯化步骤和过程，有效控制生产成本，适应规模化生产。本专利技术提供的技术方案：应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，包括以下步骤：将眼镜蛇毒预处理后，通过NGF-多克隆抗体亲和柱进行吸附、洗脱和进一步纯化，得到眼镜蛇毒神经生长因子；所述NGF-多克隆抗体亲和柱为：通过眼镜蛇毒NGF基因原核表达，纯化分离得到重组眼镜蛇毒NGF；将重组眼镜蛇毒NGF作为免疫原，免疫动物得到抗血清，并分离纯化得到NGF多克隆抗体；将NGF多克隆抗体与载体结合交联所得。进一步的，所述眼镜蛇毒NGF基因原核表达的菌株为大肠杆菌JM101。进一步的，所述眼镜蛇毒NGF基因原核表达的方法为：将眼镜蛇毒NGF基因用核酸内切酶EcoRI和HindIII酶切合成基因，用凝胶回收试剂盒回收NGF基因片段酶切产物，同时用EcoRI和HindIII酶切原核表达载体pET-32a，将酶切后的基因片段和载体通过T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pET-32a-ngf；将构建的重组质粒pET-32a-ngf转化入大肠杆菌JM101，构建表达NGF蛋白的重组菌株。进一步的，所述的眼镜蛇毒NGF基因，由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列组成。进一步的，所述眼镜蛇毒预处理的方法为：将蛇毒溶液加入缓冲液中，调节pH值为6.8～7.2，加40-50％硫酸铵，在0～4℃的环境中放置10～15小时，离心取沉淀，加超纯水复溶。进一步的，所述的NGF多克隆抗体的纯化方法为：将抗血清通过重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱进行吸附、洗脱和纯化，得到眼镜蛇毒NGF多克隆抗体；所述的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱为：将重组眼镜蛇毒NGF与载体结合交联得到的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱。进一步的，所述的载体为琼脂糖凝胶、纤维素、壳聚糖、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶、蛋白质A-琼脂糖凝胶、蛋白质G-琼脂糖凝胶、中的一种或多种。进一步的，所述的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的制作方法为：将重组眼镜蛇毒NGF抗原或NGF-多克隆抗体与生物素进行结合得到结合生物素，再将结合生物素与链亲和素琼脂糖凝胶进行结合交联；即得到所述的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱。生物素可以与抗原及抗体分别进行结合且不影响抗原及抗体之间的结合及生物活性，能快速结合，具有高度肥特异性和稳定性。两者的亲和常数比抗原-抗体高10-100万倍。一个抗原或抗体可以偶联十个生物素或亲和素分子；而生物素与亲和素分子的结合虽不属于免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定，由于1个亲和素有4个生物素分子的结合位点，因此可以连接更多的生物素化的抗原或抗体，且也能间接的提高抗原或抗体与免疫亲和柱的结合力，有效的增强免疫亲和柱的灵敏度和结合力。且生物素与亲和素结合快，且呈不可逆反应，而且在pH，温度，有机溶剂或变性剂较大的变化范围内均能稳定存在。进一步的，所述重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的制备方法为：(1)链亲和素与活化的琼脂糖凝胶的偶联用偶联缓冲液分别溶解琼脂糖凝胶及链亲和素，在琼脂糖凝胶溶液中加入链亲和素溶液；在室温下偶联4h；用PBS洗涤，得到链亲和素琼脂糖凝胶；所述的偶联缓冲液为0.1mM碳酸氢钠，0.8mM氯化钠，pH8.9；(2)结合生物素的制备将重组眼镜蛇毒NGF抗原或NGF-多克隆抗体用0.1mMpH8.0碳酸氢钠缓冲液溶解后，添加生物素进行混合、搅拌，保温2～4h后，再加入1mM氯化铵溶液，在室温下搅拌10min，并用PBS透析，得到结合生物素；(3)重组眼镜蛇毒NGF抗原免疫亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的制备用结合缓冲液分别溶解链亲和素琼脂糖凝胶及结合生物素；在室温的条件下，不断搅拌链亲和素琼脂糖凝胶，逐滴加入结合生物素溶液；搅拌反应20～22h后填充于萃取柱中加入结合缓冲液进行沉淀和洗涤；所述的结合缓冲液为：20-50mM磷酸二氢钠，100-150mM氯化钠，pH7.4-8.0。进一步的，所述重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的纯化方法为：(1)使用结合缓冲液进行平衡；(2)将抗血清或蛇毒缓慢上样；(3)使用结合缓冲液进行洗脱；(4)使用洗脱缓冲液进行洗脱并收集；所述的结合缓冲液为20-50mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH7.4-8.0；所述的洗脱缓冲液为80-100mM甘氨酸并用盐酸调节pH为2.5-3.0。本专利技术利用基因重组技术，使用产量较高的重组神经生长因子，激本文档来自技高网...

【技术保护点】
应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：将眼镜蛇毒预处理后，通过NGF‑多克隆抗体亲和柱进行吸附、洗脱和进一步纯化，得到眼镜蛇毒神经生长因子；所述NGF‑多克隆抗体亲和柱为：通过眼镜蛇毒NGF基因原核表达，纯化分离得到重组眼镜蛇毒NGF；将重组眼镜蛇毒NGF作为免疫原，免疫动物得到抗血清，并分离纯化得到NGF多克隆抗体；将NGF多克隆抗体与载体结合交联所得。

【技术特征摘要】
1.应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：将眼镜蛇毒预处理后，通过NGF-多克隆抗体亲和柱进行吸附、洗脱和进一步纯化，得到眼镜蛇毒神经生长因子；所述NGF-多克隆抗体亲和柱为：通过眼镜蛇毒NGF基因原核表达，纯化分离得到重组眼镜蛇毒NGF；将重组眼镜蛇毒NGF作为免疫原，免疫动物得到抗血清，并分离纯化得到NGF多克隆抗体；将NGF多克隆抗体与载体结合交联所得。2.根据权利要求1所述的应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，所述眼镜蛇毒NGF基因原核表达的载体为大肠杆菌JM101。3.根据权利要求1所述的应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，所述眼镜蛇毒NGF基因原核表达的方法为：将眼镜蛇毒NGF基因用核酸内切酶EcoRI和HindIII酶切合成基因，用凝胶回收试剂盒回收NGF基因片段酶切产物，同时用EcoRI和HindIII酶切原核表达载体pET-32a，将酶切后的基因片段和载体通过T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pET-32a-ngf；将构建的重组质粒pET-32a-ngf转化入大肠杆菌JM101，构建表达NGF蛋白的重组菌株。4.根据权利要求1所述的应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，所述的眼镜蛇毒NGF基因，由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列组成。5.根据权利要求1所述的眼镜蛇毒神经生长因子的纯化方法，其特征在于，所述眼镜蛇毒预处理的方法为：将蛇毒溶液加入缓冲液中，调节pH值为6.8～7.2，加40-50％硫酸铵，在0～4℃的环境中放置10～15小时，离心取沉淀。6.根据权利要求1所述的应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，所述的NGF多克隆抗体的纯化方法为：将抗血清通过重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱进行吸附、洗脱和纯化，得到眼镜蛇毒NGF多克隆抗体；所述的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱为：将重组眼镜蛇毒NGF与载体结合交联得到的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱。7.根据权利要求1或6所述的应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，所述的载体为琼脂糖凝胶、纤维素、壳聚糖、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：石聪博，吕秋敏，石聪弈，朱绍文，李瑞，
申请(专利权)人：奔驰生物科技云南有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53