本发明专利技术提供了一种利用蓝藻合成C13全标记蔗糖的生物合成方法，具体包括配制培养基、蓝藻预培养、C13标记蔗糖的生产和产物纯化等步骤。本发明专利技术提供的利用蓝藻合成C13全标记蔗糖的生物合成方法开创了以C13标记的碳酸氢钠作为唯一碳源培养蓝藻合成C13全标记蔗糖的全新技术方案，本发明专利技术可以极大程度简化C13全标记蔗糖的合成工艺，降低生产成本，具有十分重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及合成C13全标记蔗糖的方法，尤其涉及一种利用蓝藻合成C 13全标记蔗 糖的生物合成方法。
技术介绍
C13全标记蔗糖是一种重要的稳定同位素标记化合物，主要用于有机化学反应机 理、天然产品生物合成、酶促反应机理、病理试验、微生物热源检测、微生物代谢途径的研究 和应用。目前，C 13全标记蔗糖的主要合成工艺是：利用低温精馏法从自然界中分离稳定同 位素 C13,随后经过逐步的化学合成方法最终得到C13全标记蔗糖，相对于C 13标记的无机盐 碳酸氢钠，其合成工艺复杂且价格昂贵，目前每克C13全标记蔗糖的价格比每克C 13标记的碳 酸氢钠的价格高出130多倍。 蓝藻是一种光能自养原核微生物，能够利用光能固定碳源合成有机物。在盐胁迫 条件下，蓝藻可以合成蔗糖用于抵抗胞外渗透压，因此该蓝藻生产蔗糖的研究受到了广泛 的重视。但是现有技术还未见有关于利用蓝藻来合成C 13全标记蔗糖的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用蓝藻合成C13，利用本 专利技术的技术方案，可以简化C 13全标记蔗糖的合成工艺，降低生产成本，该方法可以将工业 中易于合成的C13标记的无机盐碳酸氢钠转化为高附加值产品的C 13全标记蔗糖。 为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现： -种利用蓝藻合成C13，它包括以下步骤： (1)配制培养基：选用BGll培养基为蓝藻培养基，培养基配方中的碳源选用C13标 记的碳酸氢钠； (2)蓝藻预培养：在充满氮气的环境中将蓝藻接种至所述培养基中，搅拌培养，在 蓝藻培养过程中控制PH在8-10之间；将蓝藻培养至指数生长末期时进行盐胁迫，直至检测 到培养液中C 13标记蔗糖占所产蔗糖总量达到98%以上则完成蓝藻预培养； (3)C13标记蔗糖的生产：在无菌及充满氮气的环境中对步骤（2)达标的培养液离 心浓缩，随后将菌体重悬并接种到除二氧化碳处理后的BGll培养基中，接种OD在0. 3-0. 5 之间，搅拌培养，在蓝藻培养过程中控制PH在8-10之间；待蓝藻培养到指数生长期后期时 进行盐胁迫，盐胁迫后回收含有C 13标记蔗糖的培养液； (4)产物纯化：所述培养液经离心去除菌体、分别过阴、阳离子交换柱去除无机 盐、浓缩结晶及纯化后即可得到C 13标记的蔗糖。 对上述技术方案的进一步改进：所述蓝藻为在盐胁迫条件下能产生蔗糖的聚球藻 PCC7942、集胞藻PCC 6803或鱼腥草PCC 7120中的一种或几种。 对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（1)中BGll培养基在配制过程中进行通 氮气去二氧化碳处理。 对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（2)和步骤（3)中蓝藻培养过程的温度 为 28-30°C，光强为 30-100 μΕ·πι2· s1。 对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（2)和步骤（3)中用0.1 M盐酸调节pH 在8-10之间。 对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（2)和步骤（3)中的盐胁迫均是使用无 C12污染的5M氯化钠进行盐胁迫。 与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术提供的利用蓝藻合成C13全 标记蔗糖的生物合成方法开创了以C 13标记的碳酸氢钠作为唯一碳源培养蓝藻合成C13全标 记蔗糖的全新技术方案，利用本专利技术可以极大程度简化C 13全标记蔗糖的合成工艺，降低生 产成本，具有十分重要的意义。【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。 实施例1 本专利技术所述的利用蓝藻合成C13具体包括以下步骤： 1、配制培养基： (1)培养基配方：将BGll培养基配方中的碳源限定为2-8g/L的C13标记的碳酸氢 钠，具体培养基中的母液配方如表1所示。 表1BGll培养基的8种母液（1000X)配方浓度 (2)培养基的配制步骤如下： a.按照表1分别配制8种母液，其中母液1和母液5单独灭菌； b.以配制IL BGll培养基为例：首先量取994mL ddH20,分别加入所述母液2、3、4、 6、7、8各ImL并混匀，然后再加入NaNO3L 5g，混匀溶解后即可分装灭菌； 如果是配制固体培养基，则需要加入终浓度为1. 4~1. 5%的琼脂粉后再高压灭 菌。 c.培养基的去除二氧化碳处理：将配制好的未加母液1和母液5的BGll培养基 放入厌氧瓶中并在每个瓶中加入一个转子，随后通入氮气10分钟后立即塞上橡胶塞密封， 然后在120°C，20分钟灭菌。待温度降为室温后，在厌氧操作箱内加入预先通氮气去除二氧 化碳处理的母液1和母液5,获得去除二氧化碳的BGll培养基。 2、蓝藻预培养：在充满氮气的厌氧操作箱中将蓝藻接种至装有上述去除二氧化碳 的BGll培养基的厌氧瓶中。在温度28-30°C，光强30-100 μ E ·πι2 · s \利用磁力搅拌器搅 拌培养，在培养过程中用〇. IM盐酸控制pH在8-10之间。在培养至指数生长末期时进行盐 胁迫（加入无 C12污染的5M氯化钠母液至氯化钠终浓度为150mM)，盐胁迫2天后取出上清 液，利用离子色谱-质谱联用设备对上清液中C 13标记蔗糖含量进行检测，如果培养液中C 13 标记蔗糖占所产蔗糖总量（即纯度）达到99%以上则完成菌种传代。如果所产C13标记蔗 糖的纯度达不到所要求99%，则将该批次藻株在厌氧操作箱中离心并重悬，然后接入到处 理后的培养基中继续培养、盐胁迫、检测，直至培养液中C 13标记蔗糖占所产蔗糖总量（即纯 度）达到99%以上则完成菌种预培养，并将菌种冻存。 本专利技术中用于接种的蓝藻可以为在盐胁迫条件下可以生产蔗糖的藻株如聚球藻 PCC7942、集胞藻PCC 6803或鱼腥草PCC 7120中的一种或几种，这些藻株在盐胁迫的条件 下可以通过光合作用将唯一的碳源C13标记的碳酸氢钠在细胞内通过一系列的生化反应合 成C 13全标记蔗糖。本实施例中选用的蓝藻为聚球藻PCC7942。 3、C13标记蔗糖的生产：在无菌的厌氧操作箱内，用无菌注射器吸取达标的培养液 至离心管中离心浓缩，随后将菌体重悬并接种到装有处理后培养基的厌氧瓶中，接种OD在 0. 3-0. 5之间。在温度28-30°C，光强30-100 μ E · m 2 · s \利用磁力搅拌器搅拌培养，在培 养过程中用0.1 M盐酸控制pH在8-10之间。等到藻株培养到指数生长期后期时进行盐胁 迫（加入无 C12污染的5M氯化钠母液至氯化钠终浓度为150mM)，盐胁迫4天后回收含有C 13 标记蔗糖的培养液。 4、产物纯化：培养液经过离心去除菌体、分别过阴、阳离子交换树脂填充的阴、阳 离子交换柱去除无机盐、浓缩结晶及纯化后即可得到C 13标记的蔗糖。经检测得到的C 13全 标记蔗糖的纯度大于98%。 以上实施例仅用以说明本专利技术的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实 例对本专利技术进行了详细的说明，对本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所 记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并 不使相应技术方案的本质脱离本专利技术所要求保护的技术方案的精神和范围。【主权项】1. 一种利用蓝藻合成C13，其特征在于它包括以下步骤： (1) 配制培养基：选用BGll培养基为蓝藻培养基，培养基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用蓝藻合成C13全标记蔗糖的生物合成方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）配制培养基：选用BG11培养基为蓝藻培养基，培养基配方中的碳源选用C13标记的碳酸氢钠；（2）蓝藻预培养：在充满氮气的环境中将蓝藻接种至所述培养基中，搅拌培养，在蓝藻培养过程中控制pH在8‑10之间；将蓝藻培养至指数生长末期时进行盐胁迫，直至检测到培养液中C13标记蔗糖占所产蔗糖总量达到98%以上则完成蓝藻预培养；（3）C13标记蔗糖的生产：在无菌及充满氮气的环境中对步骤（2）达标的培养液离心浓缩，随后将菌体重悬并接种到除二氧化碳处理后的BG11培养基中，接种OD在0.3‑0.5之间，搅拌培养，在蓝藻培养过程中控制pH在8‑10之间；待蓝藻培养到指数生长期后期时进行盐胁迫，盐胁迫后回收含有C13标记蔗糖的培养液；（4）产物纯化：所述培养液经离心去除菌体、分别过阴、阳离子交换柱去除无机盐、浓缩结晶及纯化后即可得到C13标记的蔗糖。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪峰，段仰凯，罗泉，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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