烟草番茄红素β环化酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种烟草番茄红素β环化酶基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。本发明专利技术研究了Ntβ-LCY基因在烟草不同时期不同器官中的转录水平表达模式，发现该基因主要表达在幼叶中；利用OE和RNAi两种方法研究了Ntβ-LCY基因在表达量变化情况下对烟草植株生长发育情况及色素含量的影响，分析了Ntβ-LCY基因在烟草中的重要功能。首先是先得到基因，可以明确而有针对性地对该基因开展研究；其次是采用稳定的转基因技术分析基因功能。

【技术实现步骤摘要】
烟草番茄红素β环化酶基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体地，本专利技术涉及烟草类胡萝卜素合成关键基因，涉及β-番茄红素环化酶基因(Ntβ-LCY)在类胡萝卜素合成及植物生长发育中的重要作用。
技术介绍
类胡萝卜素是生物体内通过类异戊二烯途径合成而呈现黄色、橙红色和红色的一类萜类物质。类胡萝卜素在植物光合作用中承担着光吸收的重要功能，主要存在于植物叶片的叶绿体及许多花和果实的有色体中，具有吸收和传递电子的能力，并在清除光合作用中产生的叶绿素三线态和单线态及超氧阴离子等自由基方面起着重要的作用。另一方面，类胡萝卜素在光抑制条件下能通过叶黄素循环，以非光化学辐射的方式耗散光系统II(PSII)的过剩能量，保护叶绿素免受氧化损伤的破坏。此外，类胡萝卜素也是植物激素脱落酸(ABA)合成的前体物，ABA广泛地参与植物生长周期发育的各个环节和抗逆过程。所以类胡萝卜素在植物生长发育过程中具有重要的作用。番茄红素环化是植物体内类胡萝卜素生物合成途径的一个重要分枝点。植物体中存在两种环化酶，一种是番茄红素β-环化酶(β-LCY)，在其催化下，番茄红素转化为β-胡萝卜素，进而生成玉米黄质、紫黄质、新黄质等叶黄素，另一种是番茄红素ε-环化酶(ε-LCY)，与β-LCY共同作用下生成α-胡萝卜素，进而生成黄体素等。β-LCY和ε-LCY两个酶的活性在一定程度上决定了两个分枝产物β-胡萝卜素、紫黄质、玉米黄质和黄体素等类胡萝卜素物质的比例及类胡萝卜素的总量。烟草是重要的经济作物，在发展地方经济、增加国家财政积累方面有突出作用。烟叶中类胡萝卜素含量与烟叶品质之间存在正相关关系，一方面烟叶外观品质与类胡萝卜素成分含量直接相关，另一方面类胡萝卜素是烟草香气成分的重要前提物质，对烟草的香气量和香气质有直接作用。研究表明类胡萝卜素是影响烤烟香气质量重要的萜烯类化合物，其降解产物占烟叶总挥发性香气成分的8％-12％。类胡萝卜素的降解和热裂解产物可生成近百种香气化合物，如巨豆三烯酮、β-大马酮等，这些香味物质阈值相对较低，刺激性较小，对烟叶香气贡献率大，是形成烤烟细腻、高雅和清新香气的主要成分。因此，在烟草中寻找类胡萝卜素合成过程中起关键作用的基因并探索其应用将具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过同源克隆的方式，从栽培烟草红花大金元体内克隆获得Ntβ-LCY基因编码区序列，并且进行了表达模式分析。利用稳定的转基因技术过量表达(overexpression,OE)和RNA干涉(RNAinterference,RNAi)方法研究了Ntβ-LCY基因在表达量变化情况下对烟草植株的生长发育情况的影响及类胡萝卜素含量的影响。本专利技术旨在探索Ntβ-LCY基因在烟草中的功能，是否直接控制着类胡萝卜素的含量，该研究结果能够为利用基因工程技术培育优良品种提供理论依据和基因资源。本专利技术的技术方案是：烟草番茄红素β环化酶基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。烟草番茄红素β环化酶基因，其RNAi序列如SEQIDNO：2所示。所述的烟草番茄红素β环化酶基因的应用，所述烟草番茄红素β环化酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过过表达和RNA干涉技术研究了该基因功能，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草番茄红素β环化酶基因的编码核酸片段作为功能序列，将该序列插入到含有35S启动子的表达框下，该表达框属于植物双源表达载体的一部分，构建烟草番茄红素β环化酶基因的过表达载体。首先，研究了Ntβ-LCY基因在烟草不同时期不同器官中的转录水平表达模式，发现该基因主要表达在幼叶中；利用OE和RNAi两种方法研究了Ntβ-LCY基因在表达量变化情况下对烟草植株生长发育情况及色素含量的影响，分析了Ntβ-LCY基因在烟草中的重要功能。首先是先得到基因，可以明确而有针对性地对该基因开展研究；其次是采用稳定的转基因技术分析基因功能。附图说明图1：定量PCR分析普通烟草中不同时期、(stage1-stage4分别为还苗期、打顶期、盛花期和成熟期)的各类器官(根-R、茎-S、叶-L(5叶位-5L，10叶位-10L，15叶位-15L)、花-F，)中Ntβ-LCY基因的转录表达模式；图2：定量PCR分析低温弱光胁迫下Ntβ-LCY基因表达模式，CON为正常条件下基因相对表达量；LL为低温弱光下基因相对表达量；图3：Ntβ-LCY转基因表型，CON为烟草未转基因对照植株；OE为Ntβ-LCY过表达植株；RNAi为Ntβ-LCY-RNAi转基因植株；图4：Ntβ-LCY-RNAi转基因沉默效果，NT为未转基因对照植株；Ntβ-LCY-RNAi为转基因植株；图5：Ntβ-LCY-RNAi转基因株系中色素含量，NT为未转基因对照植株；Ntβ-LCY-RNAi为转基因植株；图6：Ntβ-LCY-OE转基因植株筛选；图7：Ntβ-LCY-OE转基因植株β-LCY基因表达量分析，NT为未转基因对照植株；Ntβ-LCY-OE为转基因植株；图8：Ntβ-LCY-OE转基因株系中色素含量，NT为未转基因对照植株；Ntβ-LCY-OE为转基因植株。具体实施方式烟草番茄红素β环化酶基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。烟草番茄红素β环化酶基因，其RNAi序列如SEQIDNO：2所示。所述的烟草番茄红素β环化酶基因的应用，所述烟草番茄红素β环化酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过过表达和RNA干涉技术研究了该基因功能，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草番茄红素β环化酶基因的编码核酸片段作为功能序列，将该序列插入到含有35S启动子的表达框下，该表达框属于植物双源表达载体的一部分，构建烟草番茄红素β环化酶基因的过表达载体。1、Ntβ-LCY基因的同源克隆通过NCBI-Blastn搜索到Ntβ-LCY基因所有的EST序列，在ATG和TGA处设计保守引物。分别以普通烟草cDNA和基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收目的片段，T-A连接，转化大肠杆菌(DH5α)感受态，37℃培养，菌落PCR鉴定得到阳性克隆。阳性质粒提取，最后进行质粒酶切鉴定和测序得到普通烟草Ntβ-LCY编码区全长及基因全长序列。获得Ntβ-LCY编码区(CDS)全长序列1503bp，共编码500个氨基酸，Ntβ-LCY基因全长1503bp，所以Ntβ-LCY基因在烟草中不存在内含子。具体步骤如下所述：所用引物为5’-ATGGATACATTGTTGAAAACCCCAAAT-3’和5’-TTCTGTATCCTGTAACAAATTGTTGATC-3’。作为模板的cDNA和DNA都来自栽培烟草红花大金元旺长期幼叶片(RNA和DNA提取按照QIAGEN公司RNA或DNA提取试剂盒说明书进行)。按照Reversetranscriptionsystem试剂盒说明书，以Oligo(dT)18(TaKaRa公司)为引物合成cDNA第一链。PCR反应条件为94℃，3min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，1.5min，35cycles；72℃，10min；4℃，pause。反应体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
烟草番茄红素β环化酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，其特征在于：以低温弱光胁迫条件诱导烟草番茄红素β环化酶基因表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燃，史艳梅，罗朝鹏，李锋，刘萍萍，武明珠，金立锋，魏春阳，魏攀，陈霞，郑庆霞，林福呈，杨军，屈凌波，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41