桑树花青素生物合成三个关键基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了来源于桑树的花青素生物合成途径三个关键基因：黄烷酮3-羟化酶（MaF3H）、类黄酮-3′-羟化酶(MaF3′H)和二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR）的基因序列及应用。MaF3H基因片段长369bp，编码了123个氨基酸，MaF3′H基因片段长857bp，编码了285个氨基酸，MaDFR基因片段长535bp，编码了178个氨基酸。这三个基因是植物花青素合成路径中的关键基因，可以应用到植物中调控花青素的含量，改善植物的品质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物基因工程领域，特别是涉及桑树花青素生物合成三个关键基因黄烷酮3-羟化酶、类黄酮_3’ -羟化酶及二氢黄酮醇-4-还原酶基因及其应用。
技术介绍
花青素(anthocyanin)属于黄酮类化合物,是广泛存在于被子植物(主要是开花植物)中的水溶性天然色素，主要以糖苷的形式存在于植物细胞的液泡中，在液泡不同的pH值下，使花瓣呈现五彩缤纷的颜色，也是花和果实的主要色素，控制花和果实呈现红色、粉红色、蓝色和紫罗兰色等不同颜色。桑树的成熟果实桑椹，口味鲜美，色泽艳丽，花青素含量极为丰富，主要成分是矢车菊_3_匍萄糖苷(C3G)和矢车菊-3-芸香苷(C3Y),是桑堪品质的重要指标之一。在花青素生物合成途径中，黄烷酮3-羟化酶(F3H)催化黄槲皮素形成二氢黄酮醇；类黄酮_3’_羟化酶(F3' H)催化二氢黄酮醇形成二氢槲皮素；二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)分别催化二氢黄酮醇、二氢槲皮素和二氢杨梅素分别生成无色天竺葵素、无色矢车菊素和无色飞燕草素。编码这三个酶的基因是花青素生物合成途径的关键基因，直接关系到花青素的合成。因此桑树花青素生物合成关键基因黄烷酮3-羟化酶、类黄酮-3'-羟化酶与二氢黄酮醇-4-还原酶基因可应用于桑树花青素生物合成的调控，改良桑树的品质。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供桑树花青素生物合成三个关键基因黄烷酮3-羟化酶、类黄酮-3'-羟化酶和二氢黄酮醇-4-还原酶基因的核苷酸序列与氨基酸序列。本专利技术所述的桑树黄烷酮3-羟化酶基因(ife/^/7)、类黄酮-3'-羟化酶基因(MaFS' B和二氢黄酮醇-4-还原酶基因iMaDFR、序列的克隆，依次通过以下步骤得到 1)提取桑椹总RNA，并将提取的总RNA进行反转录合成cDNA； 2)根据蔷薇科植物草莓和苹果的黄烷酮3-羟化酶基因类黄酮-3'-羟化酶基因mF3，M)和二氢黄酮醇-4-还原酶基因(ifeiFT )序列，分别设计兼并引物，以前述cDNA为模板，扩增得到基因片段，连接到T克隆载体pMD19-T simple vector上，转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序。上述基因片段采用信息分析的方法预测基因结构及编码的氨基酸序列。本专利技术同时提供三个基因在不同果色果实中的表达检测 1)采用超声提取不同果色桑椹花青素，利用高效液相色谱检测花青素的含量； 2)分别提取不同果色果实总RNA，并反转录成cDNA； 3)以肌动蛋白基因作为内参，采用半定量PCR技术检测三个基因的表达情况。通过不同果色果实中的表达检测结果，可以判定黄烷酮3-羟化酶基因 类黄酮-3'-羟化酶基因(MaF3' B和二氢黄酮醇-4-还原酶基因(MDFR、在桑树花青素生物合成中起不可缺少的作用。附图说明图I为基因PCR电泳图。M Trans2000 ；1基因片段扩增 图2 #基因PCR电泳图。M Trans2000 ；1 -MaF3, #基因片段扩增 图3为JfeiFTP基因PCR电泳图。M Trans2000 ；1 基因片段扩增 图4为四个品种桑果的花青素含量图(mg/g干重)。I :珍珠白；2 :嘉陵30号；3 :大十；4 :红果I号 图5为三个基因在四个品种桑果中的表达。I :珍珠白；2 :嘉陵30号；3 :大十；4 :红果 I号 珍珠白为山东省临清市地方品种 嘉陵30号为重庆市蚕桑品种审定委员会2009年审定品种 大十为广东农业科学院蚕业研究所于1977年选育 红果I号为陕西省蚕桑丝绸研究所于2000年选育 本专利技术的优点是 本专利技术提供的花青素生物合成途径三个关键酶基因黄烷酮3-羟化酶基因类黄酮-3'-羟化酶基因功和二氢黄酮醇-4-还原酶基因(ifeiFT )，分别将其采用基因工程的方法，导入桑树中，可通过构建过表达或反义转基因表达载体，改变桑树中花青素的含量，间接改良桑树的品质，促进花青素物质的开发利用。具体实施例方式实施例I :桑树黄烷酮3-羟化酶基因(ife/^/7)、类黄酮-3'-羟化酶基因(MaFS' B和二氢黄酮醇-4-还原酶基因(MDFR)片段的克隆 1)以桑树嘉陵30号为材料，提取桑椹总RNA，并将提取的总RNA进行反转录合成cDNA； 2)根据蔷薇科植物草莓和苹果的黄烷酮3-羟化酶基因类黄酮-3'-羟化酶基因mF3，M)和二氢黄酮醇-4-还原酶基因(ifeiFT )序列，分别设计兼并引物，以前述cDNA为模板，扩增得到基因片段，连接到T克隆载体PMD19-T simple vector上，转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序。兼并引物序列如下F3H-Y 5' -CAGAGAGTTCTTCGCTTTG-3'F3H-R 5' -CAGAATTGGCTTCTCTCCT-3' F3f H-W -ATGGTGGTGGAGATGATGGTG-3'F3f H-R :5' -GCTC(G/T)TTGTAGDGTGAGCCCA-3'DFR-V 5' -AAAGATGACTGGTTGGATG-3'DFR-R 5' -CCAAGCTGTACTTGAACTC-3' 步骤I)提取总RNA的桑树也可用其它桑树品种或材料，得到相同的结果。实施例2 :不同果色桑椹中花青素含量的高效液相色谱(HPLC)检测 I)桑椹花青素的提取采摘成熟桑椹，清洗干净后置冷冻干燥器中处理24小时，取出后压碎成粉末状；配制提取液63%甲醇(含1%TFA)，按照料液比I :24g/mL的比例量取提取液，并将已称量的桑椹粉末倒入提取液中，将上述混合溶液置于超声清洗器中，在200 W、40kHZ、43. 2°C黑暗条件下超声提取40分钟，室温8000 rpm离心10分钟，取上清。用0. 45 y m孔径的有机系滤膜过滤上清液，滤出液备用；2)反相高效液相色谱定性检测花色素苷色谱柱sy_etry C18反相吸附柱(250mmX 4. 6mm, 5 u m)，流动相A为乙腈，流动相B为甲酸水(10/90，v/v)。洗脱程序采用等度洗脱，流动相A B为25% 75%,流速lmL/min，柱温30°C，检测波长520 nm,上样量为10U L。用10%甲酸溶解矢车菊素-3-葡萄糖苷标准品，并配制成lmg/mL母液，将母液分别稀释成 5 V- g/mL> 10 V- g/mL>20 u g/mL>50 u g/mL> 100 U g/mL 的浓度梯度,根据 HPLC 的峰面积与浓度构建标准曲线，根据标准曲线计算桑椹中花青素的含量(检测结果如图4所示)。实施例3 :三个基因在不同果色桑椹中的表达检测 分别提取不同果色桑椹总RNA，并反转录成cDNA，根据实施例I获得的基因片段设计半定量PCR引物，分别扩增不同桑椹的cDNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测(检测结果如图5所示)。半定量PCR引物如下 F3H-1 :5, -AAAAGGCGGTTTCATTG-3'F3H-2 5' -GATTGTTCCTGGATCTGTG-3'F3f H-I :5' -TGGCAATGGGAAGCACA-3'F3f H-2 :5' -CGCTCACAAGCCTATCTCG-3'DFR-I :5' -CCCATTTCTTAGTCCCA-3'DFR-2 5' 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.桑树花青素生物合成三个关键基因，其特征在于黄烷酮3-羟化酶基因(MaF3H)碱基序列如SEQ ID NO: I所示、类黄酮-3 ^ -羟化酶基因(MaF3' H)碱基序列如SEQ ID NO:3所示、ニ氢黄酮醇-4-还原酶基因(MaDFR)碱基序列如SEQ ID NO 5所示。2.桑树花青素生物合成三个关键基因编码的蛋白质，其特征在于黄烷酮3-羟化酶氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示、类黄酮-3'-羟化酶氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示、ニ氢黄酮醇-4-还原酶氨基酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：余茂德，李军，张琼予，刘长英，赵爱春，王茜龄，鲁成，金筱耘，吕蕊花，吴存容，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：