本发明专利技术公开一个参与丹参酮生物合成的CYP450基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。该基因为首次从丹参中克隆得到，为丹参酮类化合物生物合成途径的关键酶基因，催化次丹参酮二烯至铁锈醇的关键步骤。本发明专利技术所提供的CYP76Q1基因具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有序列表中SEQ?IDNo.2的氨基酸残基序列以及具有SEQ?IDNo.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ?IDNo.2衍生的蛋白质。本发明专利技术提供的CYP76Q1基因与丹参酮类化合物生物合成密切相关，对于调节生产植物二萜类化合物和通过生物技术提高丹参中二萜类活性成分丹参酮类的含量具有重要的理论和实际意义，有助于丹参药材的品质改良，品种选育，同时可以通过利用该基因构建要程菌生产具有药理活性的铁锈醇单体，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用丹参转录组文库筛选丹参酮类化合物代谢途径相关CYP450基因，并利用体外酶促反应的方法对该基因编码蛋白进行功能活性分析，涉及到丹参主要活性成分丹参酮类化合物生物合成途径中CYP450基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。
技术介绍
药用植物有效成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因表达的产物，随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为诠释药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制、为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标 成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用前景。丹参为唇形科鼠尾草属药用植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效，其主要有效成分包括脂溶性的丹参酮和水溶性的丹酚酸。其中丹参酮类主要包括隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮IIB和二氢丹参酮等，具有扩张血管、抗血栓、抗菌消炎以及抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用，在制药以及美容、化妆品等领域得到广泛应用。丹参酮类化合物为松香烷型二萜琨类化合物，其生物合成在職类化合物前体物质合成的基础上，通过异戍二烯基转移酶(Prenyl Transferases,PT)的作用产生20个碳原子的物牛儿基物牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl Diphosphate,GGPP)，GGPP 进一步在丹参柯巴基焦憐酸合酶(S. miltiorrhiza Copalyl DiphosphateSynthase, SmCPS)和丹参类贝壳杉烯合酶(S. miltiorrhiza ent-kaurene Synthase, SmKS)的作用下形成丹参类化合物的基本骨架次丹参酮二烯(Miltiradiene)，在次丹参酮二烯的基础上经过甲基化和羟基化等形成丹参酮类化合物，其中细胞色素P450(CYP450)酶在修饰过程发挥着重要作用。CYP450酶为血红蛋白结合蛋白，在所有已知的CYP450酶中都存在一个保守的血红素结合域，是鉴定该基因的一个重要特征。拟南芥基因组中有272个CYP450基因，水稻基因组注释显示有457个CYP450基因，如此庞大的基因家族反映了植物次生代谢物的复杂多变。各种CYP450酶催化的反应广泛并且复杂，包括羟基化、N-、0-和S-端的脱烷基化、环氧基化、脱氨基作用、脱硫、脱卤作用和过氧化反应等。尽管催化反应各异，催化机理却相同，即通过NADPH或者NADH为CYP450传递电子，激活氧分子，将其中的一个氧插入到底物上，同时生成一分子水。CYP450酶作为萜类、黄酮类、脂肪酸类和植物激素等合成代谢途径的一类重要酶蛋白，不但催化相关代谢反应，由于大多数的CYP450蛋白均有一段内质网膜定位蛋白，因此在代谢区室(Metabolon)的酶复合体中还具有固定酶复合体的作用。随着分子生物学以及相关检测技术的不断发展，次生代谢途径相关的CYP450基因功能逐渐得以验证。真核表达、原核表达以及RNA干扰(RNA Interference)等技术在CYP450基因的功能验证中发挥了重要作用。近年来利用真核表达以及RNAi技术使得CYP450酶在紫杉酚、青蒿素、植物抗毒素等代谢途径中的重要作用逐渐被解析。但是作为在植物次生代谢中发挥作用的CYP450表达量相对较低，并且大多CYP450蛋白具有严格的催化底物结构特异性，同时基因组中广泛存在的CYP450基因为次生代谢相关基因的克隆和功能验证提供了难度，使之成为了近年来国际学术界的研究热点之一。本实验室在前期研究的基础上已克隆到了丹参酮化合物合成途径的上游的相关关键酶基因，并通过构建工程菌产生了丹参酮化合物的前体次丹参酮二烯。本专利技术涉及的是催化次丹参酮二烯(Miltiradiene)在C-12的羟基化产生丹参酮类化合物合成途径中间产物铁秀醇(Ferruginol)的关键CYP450酶基因，该基因是首次从丹参中得到的丹参酮类生物合成的关键CYP450基因，依据CYP450基因命名法则命名为CYP76Q1。在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中涉及的CYP76Q 1基因及其氨基酸序列。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个丹参酮化合物生物合成代谢途径的CYP450基因CYP76Q1，其编码的蛋白在含有NADPH的缓冲体系中能催化次丹参酮二烯生成铁锈醇。本专利技术提供了一种与丹参酮类化合物合成代谢有关的基因CYP76Q1，它是序列表中SEQ ID No. I所示的DNA序列。以及一种由上述基因CYP76Q1编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸残基序列以及具有SEQ IDNo. 2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ IDNo. 2衍生的蛋白质。本专利技术SEQ ID No. I的DNA序列由1488个碱基组成，编码序列表中由495个氨基酸残基组成的蛋白质序列SEQ ID No. 2。本专利技术克隆的基因CYP76Q1在积累丹参酮类化合物的丹参根中表达明显高于不积累丹参酮类化合物的茎叶等地上部分。含有本专利技术基因CYP76Q1的表达载体、细胞系及宿主菌和使用该基因在调节和生产植物二萜类化合物及丹参育种中的应用也在本专利技术的保护范围之内。将SEQ ID No. I基因克隆到真核表达载体PESC-His的限制性内切酶EcoR I和Sep I位点间，构建带有CYP76Q1基因的重组表达载体PESC-CYP76Q1 ;转入酵母菌株WATll表达宿主菌采用半乳糖诱导表达。通过提取表达菌株微粒体，加入到以次丹参酮二烯为底物的体外酶促反应体系中，正己烷萃取反应产物，GC-MS分析。GC-MS分析结果表明次丹参酮二烯在CYP76Q1蛋白酶的催化下，生成了分子量为286 (m/z)的新物质，通过分析新产物的分子离子峰与主要裂解方式，认为该产物为铁锈醇。研究结果表明，本专利技术与丹参酮类化合物合成有关的基因具有细胞色素P450基因的特征结构域，酶促反应分析发现该基因催化次丹参酮二烯的C-12羟基化形成丹参酮类化合物中间产物铁锈醇，对于调节和生产植物二萜类化合物及培育高品质的丹参具有重要的理论及实际意义。附图说明图1CYP76Q1基因在不同组织部位的表达情况尺根，3:茎，1^叶图2重组质粒pESC-CYP76Ql的PCR鉴定M DNA 分子量标准(DL2000) ；P PCR 产物图3CYP76Q1基因编码蛋白酶促反应产物GC-MS分析A CYP76Q1催化反应产物总离子图；B :空载体催化反应产物总离子图；C :CYP76Q1催化产物峰铁锈醇(Ferruginol)对应质谱图；D :铁锈醇(Ferruginol)标样质谱4CYP76Q1基因编码蛋白催化次丹参酮二烯至铁锈醇图示具体实施例方式实施例I :丹参酮类化合物合成代谢途径CYP450基因的筛选通过本实验构建的转录组数据库，挑选表达差异上调的CYP450基因进行生物信息学分析显示这些诱导表达上调的CYP450基因主要来自CYP76，CYP716，CYP81和CYP71等家族，其中CYP76利CYP71家族在萜类合成途径中起关键的催化作用，对其中来自这本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一个与丹参酮类化合物生物合成相关的CYP450基因CYP76Q1，其核苷酸序列如SEQIDNo. I 所示。2.根据权利要求I所述的基因，其特征在于该基因的读码框为SEQID No. I的第1-1488位核苷酸。3.一个由权利要求I所述的基因CYP76Q1编码的蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，郭娟，申业，张夏楠，高伟，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：
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