【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子鉴定，尤其涉及一种重楼物种鉴定的引物对及其鉴定方法。
技术介绍
1、重楼，中药名。入药部位为百合科植物云南重楼(滇重楼，paris polyphyllasmith var.yunnanensis)或七叶一枝花(华重楼，paris polyphylla smithvar.chinensis)的干燥根茎。其味苦，性微寒；有小毒。有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊之功效，常用于疔疮痈肿，咽喉肿痛，蛇虫咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐。目前为我国云南白药、宫血宁胶囊等262种中成药的主要原料，在中医药行业中具有重要的经济、社会价值。
2、这两物种的分布区差异较大，生态位不同，因此这两个物种的适生条件与种植方式上存在较大差异。选择不同物种所适应的最适种植地与方式才能高效的生产出更优质的药材。然而，这两个物种的种苗极为相似，极易混淆。同时，两物种生长周期均较长，至少需要种植7～8年才能出售。如若发生种质混杂，进而选择了不恰当的种植方式将对种植户及市场造成巨大影响。
3、dna条形码是应用有足够变异的标准化短基因片段对物种进行快速、准确鉴定的新的生物身份识别系统，需要开发高效的dna条形码鉴定标记来解决这个问题。现有的核基因片段存在多拷贝及外缘生物污染的问题，并且中药材具有特殊性，很多情况是加工过的材料，dna降解严重，因此并非任意的dna条形码均能够准确识别亲缘关系特别近的中药材。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种重楼物种鉴定的引物对及其鉴
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种重楼物种鉴定的引物对，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的引物paris_18214f和核苷酸序列如seq id no.2所示的引物paris_18382r。
4、本专利技术还提供了一种重楼物种鉴定的引物对，包括核苷酸序列如seq id no.3所示的引物paris_41130f和核苷酸序列如seq id no.4所示的引物paris_41326r。
5、本专利技术还提供了一种重楼物种鉴定方法，包括如下步骤：
6、采用所述的引物对对样品的基因组dna进行pcr扩增，得到目的序列，对目的序列进行测序；
7、当测序后第44bp处碱基为t时，所述样品为滇重楼；
8、当测序后第44bp处碱基为g时，所述样品为华重楼。
9、本专利技术还提供了一种重楼物种鉴定方法，包括如下步骤：
10、采用所述的引物对对样品的基因组dna进行pcr扩增，得到目的序列，对目的序列进行测序；
11、当测序后第48bp处碱基为a时，所述样品为滇重楼；
12、当测序后第48bp处碱基为g时，所述样品为华重楼。
13、优选的，所述pcr的反应体系为：ddh2o 11.8μl、10×taqbuffer 2μl、浓度为2mmol/l的dntp 2μl、浓度为5μmol/l的正反向引物2μl、浓度为2.5u/μl的taq酶0.2μl、dna模板2μl。
14、优选的，所述pcr的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃最后延伸5min。
15、本专利技术还提供了所述的引物对在鉴别滇重楼和华重楼中的应用。
16、本专利技术还提供了一种鉴定重楼物种的试剂盒，包括所述的引物对。
17、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
18、本专利技术所设计的dna条形码区域为叶绿体片段，不是核基因片段，不存在多拷贝的情况。
19、本专利技术所设计的dna条码区域片段短，长度为200bp以内，远远短于其他dna条码片段。由于降解现象是中药材普遍存在的现象，较短的条码片段有利于提高降解材料的pcr扩增效率。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种重楼物种鉴定的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物Paris_18214F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物Paris_18382R。
2.一种重楼物种鉴定的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物Paris_41130F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物Paris_41326R。
3.一种重楼物种鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.一种重楼物种鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求3或4所述的重楼物种鉴定方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为ddH2O 11.8μL、10×Taqbuffer 2μL、浓度为2mmol/L的dNTP 2μL、浓度为5μmol/L的正反向引物2μL、浓度为2.5U/μL的Taq酶0.2μL、DNA模板2μL。
6.根据权利要求3或4所述的重楼物种鉴定方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次
7.权利要求1或2所述的引物对在鉴别滇重楼和华重楼中的应用。
8.一种鉴定重楼物种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物对。
...【技术特征摘要】
1.一种重楼物种鉴定的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的引物paris_18214f和核苷酸序列如seq id no.2所示的引物paris_18382r。
2.一种重楼物种鉴定的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no.3所示的引物paris_41130f和核苷酸序列如seq id no.4所示的引物paris_41326r。
3.一种重楼物种鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.一种重楼物种鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求3或4所述的重楼物种鉴定方法，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭兰萍，汪奕衡，孙嘉惠，王婧屹，乔萍，刘航秀，王升，袁庆军，池秀莲，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：
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