【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物合成领域，具体涉及一种酶法制备甘草次酸的方法及其应用。
技术介绍
1、甘草次酸，又称为beta-甘草亭酸，英文名称glycyrrhetinic acid，属于三萜类化合物，是甘草酸在体内的酶经水解作用脱去两分子葡萄糖醛酸的产物，其分子式为c30h46o4，分子量大小为470.69，其物理性质为白色针状晶体，溶于乙醇、氯仿吡啶，不溶于石油醚，结构式如下所示。
2、
3、甘草次酸是甘草酸水解两个葡萄糖醛酸基而得到的产物，含有特殊的官能团如羟基、羧基和乙酰基。正因为这些特殊的官能团才可以发生一些特殊的反应，结构中含有的羧基在一定环境中可与碱性化合物发生酸碱反应，例如氢氧化钾的乙醇溶液；如果甘草次酸的羧基发生脱水反应，则增加双键结构和分子缩合等反应生成共轭双烯键，且在酸性反应下可形成正碳离子，发生显色反应，因此，甘草次酸可在紫外-可见光区域进行检测辨认。
4、临床上以甘草次酸来作为治疗各种肝炎、支气管炎和艾滋病等药物的主要活性成分。当前医学研究表明，甘草次酸具有抗炎、抗肿瘤、抗癌、抗心律失常等许多药用价值。目前，甘草次酸的制备方法主要有以下两点：以甘草为原料直接萃取获得；以甘草酸为原料进行酸化裂解、碱化裂解和化学转化获得。直接萃取法操作简单，但甘草次酸含量很低，萃取难度较大，产品的纯度和收率低；以甘草酸为原料酸化裂解虽然能使产品纯度提高，但酸解条件较难控制。另外还有反应条件苛刻、环境污染和转化率低等问题。
技术实现思路
1、为了解决上述
2、本专利技术的第一方面，提供了一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
3、1)培养可表达β-葡萄糖醛酸苷酶的基因工程菌；
4、2)诱导β-葡萄糖醛酸苷酶的表达；
5、3)配制β-葡萄糖醛酸苷酶的粗酶液；
6、4)以甘草酸为底物，在ph为4.8-5.2，反应温度35℃-45℃条件下，由β-葡萄糖醛酸苷酶催化合成甘草次酸，反应时间8-12min。
7、申请人发现，在一定范围内，pgus-e的活性随着反应的温度升高而增强，但是在温度达到40℃左右时，酶的活性不再随着温度的升高而升高，超过40℃后，温度的升高会导致酶蛋白的变性，导致酶活性下降，40℃左右pgus-e活性最佳。进行ph测定实验后，在一定范围内，pgus-e的活性随着反应的ph升高而增强，过酸过碱都会影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性失活。酶在ph为5时，该酶的构象和电荷都处于特定反应的最适状态。
8、5)酸沉：调节反应液ph值至4.8-5.2，离心得滤饼；更具体地，加1mol/l硫酸调节反应液ph值至ph＝5，搅拌，离心，过滤得滤饼，滤饼用2-10℃水淋洗，至淋洗液为中性；
9、6)析晶：滤饼加热溶解并保持15-25min，再降温至0-5℃，在0-5℃条件下放置2-3h，干燥，得甘草次酸；更具体地，滤饼加40％乙醇加热至60℃溶解，保持20min，以1℃/min降至5℃，在0-5℃条件下放置2-3h，过滤，滤饼干燥，得甘草次酸。
10、酸沉步骤是为了去除物料中的糖苷和大分子蛋白，提高物料的纯度；析晶是为了得到更高纯度的甘草次酸并获得收率。
11、以甘草酸为底物测定β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力和产量：取ph为5.0的甘草酸溶液，加入β-葡萄糖醛酸苷酶的粗酶液，40℃水浴反应10分钟，取反应液，加入离心管，再经有机滤膜过滤至样品池。
12、普通的β-葡萄糖醛酸苷酶是一种糖苷类水解酶，能催化水解各种类型β-葡萄糖醛酸苷类化合物，但是酶的选择性不强。从新疆甘草主产区土壤中筛选到一株真菌
13、p.purpurogenumli-3(源自郭晓晓、王小艳、李春，penicillium purpurogenumli-3产β-葡萄糖醛酸苷酶的研究及其在毕赤酵母中的初步表达)，将它的β-葡萄糖醛酸苷基因导入到大肠杆菌，重组表达得到的β-葡萄糖醛酸苷酶基因可选择性提高。本专利技术的β-葡萄糖醛酸苷酶为p.purpurogenumli-3中的β-葡萄糖醛酸苷酶。
14、所述的基因工程菌包括但不限于大肠杆菌。
15、步骤1)中，表达β-葡萄糖醛酸苷酶的基因工程菌振荡培养过夜，按照0.8-1.2％的接种量转到lb培养基中，lb培养基包括酵母粉、蛋白胨和氯化钠。
16、步骤2)中，向表达β-葡萄糖醛酸苷酶的基因工程菌中加入iptg，15-17℃诱导表达11-13h。
17、iptg作为一种催化剂，在此温度和时间下，iptg促进蛋白(即β-葡萄糖醛酸苷酶)大量表达，不会被细菌代谢，性质稳定。
18、步骤3)，使步骤2)制得的诱导培养的菌体在5500-6500rpm条件下进行10-20min冷冻离心以收集菌体，将菌体经细胞破碎缓冲液洗涤后重悬，在冷却循环水中高压破碎，即得β-葡萄糖醛酸苷酶的粗酶液。
19、本专利技术的第二方面是提供前述的酶法制备甘草次酸的方法在提高甘草次酸产量、纯度、转化率和得率中的应用。
20、本专利技术中，重组蛋白pgus-e诱导表达中的诱导剂要用β-葡萄糖醛酸苷酶重组表达菌bl21，在37℃170rpm振荡培养过夜，按照1％的接种量转到培养基中，最后加iptg，转入16℃诱导表达12小时。
21、本专利技术中，pgus-e的最适ph为5.0，最适温度在35℃-45℃(优选40℃)。
22、本专利技术中，粗酶液的制备：诱导培养的菌体6000rpm 15分钟冷冻离心收集菌体，将菌体经细胞破碎缓冲液洗涤3次后用40ml重悬，冷却循环水中高压破碎，即得。
23、取菌液于5000*g条件下离心15min，用pbs(ph7.9)对沉淀进行重悬，加入pmsf后于冰浴条件下超声破碎1h，随后在20000*g、4℃条件下离心20min，使用ni亲和层析柱对目的蛋白进行亲和层析，目的蛋白随洗脱液一起流下，收集并在水中透析两次，每次1-2小时，而后透析过夜，透析结束后袋子中蛋白会有所析出而使袋内液体呈现白色，收集透析后液体在离心管中，得到纯酶液，-80℃冰箱放置过夜。
24、本专利技术中，以甘草酸为底物测定β-葡萄糖醛酸苷酶：取200μl 2g/l ph为5.0的甘草酸溶液，加入50μl一定浓度的纯酶液，40℃水浴反应10分钟，取100μl反应液，加入至装有900μl甲醇的1.5ml离心管，样液经孔径为0.45μm的有机滤膜过滤至样品池。
25、与现有技术相比，本专利技术所制备甘草次酸具有以下优点：酶法制备甘草次酸反应条件温和、无污染、反应速率快和化学键选择本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，反应温度为40℃。
3.根据权利要求1所述的一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，步骤4)中以甘草酸为底物测定β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力和产量：取pH为5.0的甘草酸溶液，加入β-葡萄糖醛酸苷酶的粗酶液，40℃水浴反应10分钟，取反应液，加入离心管，再经有机滤膜过滤至样品池。
4.根据权利要求1所述的一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，所述的基因工程菌为大肠杆菌。
5.根据权利要求1所述的一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，步骤1)中，表达β-葡萄糖醛酸苷酶的基因工程菌振荡培养过夜，按照0.8-1.2％的接种量转到LB培养基中，LB培养基包括酵母粉、蛋白胨和氯化钠。
6.根据权利要求1所述的一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，步骤2)中，向表达β-葡萄糖醛酸苷酶的基因工程菌中加入IPTG，15-17℃诱导表达11-13h。
7.根据权利要求1所述的一种酶法制备甘草次酸的方法
8.根据权利要求1所述的一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，该方法所制得的甘草次酸成品纯度在98.5％以上，单个杂质含量≤0.7％，残渣检测≤0.2％。
9.权利要求1-8任意一项所述的酶法制备甘草次酸的方法在提高甘草次酸产量、纯度、转化率和得率中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，反应温度为40℃。
3.根据权利要求1所述的一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，步骤4)中以甘草酸为底物测定β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力和产量：取ph为5.0的甘草酸溶液，加入β-葡萄糖醛酸苷酶的粗酶液，40℃水浴反应10分钟，取反应液，加入离心管，再经有机滤膜过滤至样品池。
4.根据权利要求1所述的一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，所述的基因工程菌为大肠杆菌。
5.根据权利要求1所述的一种酶法制备甘草次酸的方法，其特征在于，步骤1)中，表达β-葡萄糖醛酸苷酶的基因工程菌振荡培养过夜，按照0.8-1.2％的接种量转到lb培养基中，lb培养基包括酵母粉、蛋白胨和氯...
【专利技术属性】
技术研发人员：季浩，刘竹梅，阚建伟，
申请(专利权)人：江苏天晟药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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