本发明专利技术公开了一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法，属于生物法不对称合成手性化合物技术领域。本发明专利技术筛选得到来源于海洋的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)，在加入底物酮、氨基供体和辅助底物情况下，利用该菌株的全细胞及粗酶液催化酮不对称还原胺化制备手性胺。本发明专利技术确定了该菌株全细胞催化和粗酶液催化的不对称还原胺化的反应体系和反应条件。本发明专利技术在生物催化制备手性胺领域具有较好的工业应用前景，对于今后海洋新型生物催化剂的开发和手性胺的绿色合成方法的研究具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，利用全细胞以及 粗酶液催化不对称还原胺化获得手性胺。
技术介绍
海洋是复杂、开放、变化的生物有机系统，其复杂的结构特征造就了生物类群的多 样性。海洋细菌有着其他生态系统成员不具有的特性，成为新型独特的生物催化剂的重要 来源。海洋环境独特性以及细菌产酶多样性，使得海洋蛋白与陆地生物蛋白有着极大差异。 独特海洋环境造就具有耐盐、耐热、适冷、耐压和耐酸、耐碱等特性的极端酶。近年来，国内 外科研工作者在海洋细菌生物酶资源开发方面取得了许多成果。目前研究工作较多集中于 脂肪酶、蛋白酶、溶菌酶、转移酶和多糖水解酶等。对海洋氧化还原酶的催化特性研究也逐 渐受到重视，不仅可认知生物合成的新途径和新机理，探讨关键代谢过程和生物合成机制， 也可可实现海洋资源高值化。 手性胺是许多生物活性分子的结构单元，是重要的医药和精细化工中间体。约 40%的光学活性药物含有手性胺单元。我国已成为全球最大的原料药生产国和出口国，但 长期以来面临着产品全世界使用，但污染留在中国的严峻问题。因此，高效生物催化是解决 手性药物制造并减少环境污染等问题的重要途径。手性胺高效制备技术是手性药物领域发 展的关键技术。手性胺的化学制备方法主要有:氨基酸或其衍生物的还原、醛或酮与亚胺的 偶合以及环氧化合物的氨基化开环等。生物法制备手性胺主要通过酶催化拆分或不对称还 原实现。用于制备手性胺的酶主要有脂肪酶、转胺酶和氧化还原酶。相比较而言，胺脱氢酶 催化酮和氨基供体不对称还原胺化制备手性胺简洁高效而且易实现辅酶再生。 目前，胺脱氢酶主要由氨基酸脱氢酶突变获得，直接通过筛选获得的胺脱氢酶较 少。研究报道，从Streptomyces virginiae IF0 12827中分离纯化得到依赖辅酶NADH的胺 脱氢酶，在pH 10的条件下催化系列羟酮还原胺化生成氨基醇，pH 7时反方向催化氨基醇生 成相应的羟酮。但该酶的反应选择性尚属较低，且无基因和蛋白结构等信息的报道。因此， 筛选含有催化不对称还原胺化高活性高选择性的胺脱氢酶的菌株是实现手性胺有效制备 的关键。海洋环境中长期的演化过程使得海洋微生物体内的氧化还原酶具有与陆地来源酶 不同的底物特异性和立体选择性。因此从海洋微生物中筛选得到新型胺脱氢酶将开辟新的 胺脱氢酶的来源。 专利技术人之前筛选获得的来源于海洋的基尔假单细胞菌（Pseudomonas kilonensis)的胺脱氢酶，已获得专利授权(ZL201310198839.6)。在前期工作的基础上，本 申请进一步对海洋来源菌株进行筛选。
技术实现思路
本专利技术提供了，从海洋微生物 筛选获得含有依赖NADH的胺脱氢酶的不同以往报道的新菌株巴利阿里假单胞菌 (Pseudomonas balearica)，并考察了氨基供体、反应缓冲液、pH、温度等影响，优化了该菌 株全细胞催化及其粗酶液催化酮不对称还原胺化制备的反应体系和反应条件。 本专利技术的技术方案如下： 一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，利用巴利阿里假单胞菌（Pseudomonas balearica)进行培养，制备全细胞或粗酶液；以酮为底物，加入氨基供体以及辅助底物用于 辅酶循环再生，利用全细胞或者粗酶液催化不对称还原胺化得到产物手性胺;包括： 1)菌株的培养:将巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)以1 % (ml/ml)的 接种量接种入216L培养基中培养;所述巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市中国科学院微 生物研究所，保藏日期为2014-03-25，CGMCC编号为8967; 2)全细胞的制备:将步骤1)培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉 淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心若干 次，获得细胞;将细胞用缓冲液配制成25~5000mg/L的细胞液； 或 2 '）粗酶液的制备:将步骤1)培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉 淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心若干 次，获得细胞;细胞用超声破碎仪破碎后离心，得到含有胺脱氢酶的粗酶液，用缓冲液调节 粗酶液浓度至5~1500mg/L; 3)全细胞催化：以步骤2)得到的25~5000mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体 系：0.001~0.05mol/L酮，0.002 ~0.2mol/L 氨基供体，0.001~0.2mol/L 辅助底物，0.01~ 0 · 2mo 1/L的缓冲液，25~5000mg/L的细胞，反应体系pH 7~13，在0°C~70°C反应温度下， 100~300rpm震荡反应，反应时间30~180小时，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物 手性胺； 或 3'）粗酶液催化：以步骤2'）得到的5~1500mg//L的粗酶液为基础配制粗酶液催化 体系：0 ·001 ~0 ·05m〇VL酮，0 ·002~0· 2mol/L氨基供体，0 · 001 ~0 · 2mol/L辅助底物，0 ·01 ~0 · 2mol/L的缓冲液，5~300mg/L的粗酶液，反应体系pH 8~12，在10°C~70°C反应温度 下，100~300rpm震荡反应，反应时间10~90小时，利用粗酶液催化不对称还原胺化得到产 物手性胺。本专利技术的关键在于： (1)微生物催化转化反应的反应体系采用本专利技术生产手性胺时，是利用胺脱氢酶的高度对映体选择性，催化酮的不对 称还原胺化，获得R-胺或S-胺，葡萄糖等辅助底物加入用于辅酶NAD(P)H的循环再生。其以 葡萄糖为辅助底物的化学反应式如下(式中Microorganism意为全细胞，crude enzyme意为 粗酶液）： 反应体系所涉及的酮的分子结构式如通式I所示：其中心，1?2是02~10的烷基、芳香基或羟基，均可任选被取代基取代一次或多 次。其中，对芳香酮以及分子式为CxHy0,其中X为4~7，y为8~14,酮的分子量为72~ 115的脂肪酮具有较好的催化活性和选择性。 相应地，反应体系中所涉及的胺的分子结构式如通式II所示： 其中，不对称还原胺化具有对映体选择性，对R型的选择性更好，得到的产物手性 胺为R型。 反应体系涉及的氨基供体为:丙氨酸、氨水、NH4CUNH4NO3或氨基烷烃中的一种或 多种，其中优选氨水和/或NH4C1。 反应体系涉及的辅助底物为:葡萄糖、甘油、乙醇、甲酸、异丙醇、仲丁醇中的一种 或多种，其中优选葡萄糖和甘油。反应体系涉及的缓冲液为:pH为7~13的Tr is-盐酸、乙酸钠、碳酸钠、碳酸钾中的 一种或多种，其中优选pH为9的Tris-盐酸缓冲液。所述步骤1)中的培养条件为:起始pH6.0~8.0，装液量体积分数为5%~30%，培 养温度25~35°C，摇床转速100~300rpm，培养时间24~72小时。所述步骤1)中，216L培养基组成为10.0 g/L蛋白胨，5. Og/L酵母粉，0.5g/L牛肉膏， 0.5g/L柠檬酸钠，0.2g/L NH4N03，1. Og/L醋酸钠，用海水配置。 (2)催化转化反应的条件本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，其特征在于：利用巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)进行培养，制备全细胞或粗酶液；以酮为底物，加入氨基供体以及辅助底物用于辅酶循环再生，利用全细胞或者粗酶液催化不对称还原胺化得到产物手性胺；包括：1)菌株的培养：将巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)以1％的接种量接种入216L培养基中培养；所述巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC编号为8967；2)全细胞的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉淀重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬‑洗涤‑离心若干次，获得细胞；将细胞用缓冲液配制成25～5000mg/L的细胞液；或2’)粗酶液的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉淀重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬‑洗涤‑离心若干次，获得细胞；细胞用超声破碎仪破碎后离心，得到含有胺脱氢酶的粗酶液，用缓冲液调节粗酶液浓度至5～1500mg/L；3)全细胞催化：以步骤2)得到的25～5000mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.001～0.05mol/L酮，0.002～0.2mol/L氨基供体，0.001～0.2mol/L辅助底物，0.01～0.2mol/L的缓冲液，25～5000mg/L的细胞，反应体系pH 7～13，在0℃～70℃反应温度下，100～300rpm震荡反应，反应时间30～180小时，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物手性胺；或3’)粗酶液催化：以步骤2’)得到的5～1500mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系：0.001～0.05mol/L酮，0.002～0.2mol/L氨基供体，0.001～0.2mol/L辅助底物，0.01～0.2mol/L的缓冲液，5～300mg/L的粗酶液，反应体系pH 8～12，在10℃～70℃反应温度下，100～300rpm震荡反应，反应时间10～90小时，利用粗酶液催化不对称还原胺化得到产物手性胺。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王世珍，方柏山，任红，林鹏，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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