本发明专利技术涉及一种基因工程技术领域的PGENE基因以及在番茄系统中表达PGENE功能蛋白的方法，该基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示，该方法包括以下步骤：PGENE基因表达载体的构建；所述包含PGENE基因表达载体的农杆菌转化番茄；转基因番茄外源基因整合和转录后RNA的检测；PGENE功能蛋白的提取。本发明专利技术通过构建植物表达载体，在植物中表达PGENE活性蛋白，该蛋白在预防诺如病毒引起的非细菌肠胃炎方面具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因工程领域人工合成的病毒基因以及在植物中表达功能蛋白的方法，具体涉及一种诺如病毒P粒子的PGENE基因以及在番茄系统中表达PGENE功能蛋白的方法。
技术介绍
诺如病毒(Norovirus，简称NVs)是导致人类非细菌性急性胃、肠炎的主要病原；该病毒可以感染各年龄段人群，婴幼儿、老年人和免疫系统缺陷病人属于易感人群；该病全年均可发生，冬季属于高发期(MountsAW，etal传染病学2000，181 (2) =284-287);感染力仅次于轮状病毒(BogaJA，etal微生物诊断2004，42 (6) :2668-2674)。NVs属于正义单链RNA病毒(GreenKY，etal传染病学，2000，181 (2) :S322_330)，NVs基因组易发生变异，导致其抗原性改变，毒株进化较快，因而疫情难以控制。疫苗是临床防治NVs疫情爆发主要手段 之一，NVs衣壳蛋白的亚基疫苗是NVs疫苗研究热点之一。实验证实(XiaM，etal医学杂志2007，79 (I) 74-83)，小鼠通过肌肉注射或喂饲酵母源的VA387的VLPs可以产生免疫应答，未经纯化的酵母提取物在没有佐剂情况下也可诱导小鼠产生免疫反应；用昆虫表达诺如病毒VLPs用于注射小鼠时，同样能引起小鼠的免疫应答。目前，对NVs疫苗研究仅局限于病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),而用NVs衣壳蛋白P粒子作为亚基疫苗，特别是用植物系统生产NVs衣壳蛋白P粒子疫苗尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术中的不足，按植物偏爱密码子设计合成诺如病毒P粒子基因并提供一种在转基因番茄果实中生产口服NVs衣壳蛋白P粒子疫苗的方法，通过食用转基因番茄果实达到预防诺如病毒的感染，本产品在广泛预防Norovirus病毒感染和生产预防和治疗疫苗方面弥补了细菌、酵母和昆虫等表达病毒样颗粒的局限性，具有重要应用和理论价值。本专利技术通过以下技术方案实现一种诺如病毒P粒子的PGENE基因，是按照植物偏爱子密码设计合成的核苷酸序列，将该基因置于番茄果实特异表达启动子ES基因下游，并在其5，端添加编码6XHis-tag核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO. I所示。一种表达载体，该表达载体包括如SEQIDNO. I所示的碱基序列。一种在番茄中表达PGENE功能蛋白的方法，该方法包括如下步骤步骤一，PGENE基因表达载体的构建，所述构建的具体过程如下(I)、用SpeI和BstEII双酶切含有PGENE基因的载体pUC57_PGENE，回收目标DNA片段，获得带有相应粘性末端的目的基因PGENE，同时利用SpeI和BstEII双酶切载体 p2302-gfp(该载体骨架为pCAMBIA2301)，回收大片段，然后将两个所述片段连接并转化大肠杆菌DH5 a，得到中间载体p2302-PGENE ；(2)、用KpnI和SpeI双酶切中间载体p2302_PGENE，并用相同的酶切含有番茄果实特异性表达E8启动子全长的载体pMD18T-E8full2，回收目的DNA片段；(3)、将回收的所述目的DNA片段连接构成表达载体质粒，用PCR和测序两种方法鉴定所述表达载体质粒，在确认所述表达载体质粒中目的基因阅读框架正确无误前提下，将所述表达载体质粒用冻融法导入农杆菌中，获得包含PGENE基因表达载体质粒的农杆菌；步骤二、所述包含PGENE基因表达载体质粒的农杆菌转化番茄，所述转化的具体过程如下(I)将表面消毒的黄楼桃番爺 22 号(Solanum lycopersicum var. cerasiformeyellow cherry No. 22)种子播于MS发苗培养基上，取其小苗的下胚轴和子叶作为外植体进行遗传转化； (2)将所述包含PGENE基因表达载体的农杆菌于28°C摇菌培养至OD6tltl = 0. 8 I.0时，室温6000rpm离心5分钟；(3)弃上清，菌体用MS液体培养基重悬，然后加入无菌外植体浸泡6分钟；(4)取出转化后的外植体，置于共培养基上，在25°C暗黑条件下共培养36小时；(5)共培养结束后将所述外植体转移到愈伤组织诱导培养基上，在25 28°C光照下培养，光周期为光照16h和黑暗8h，培养至愈伤组织形成，然后转到分化培养基上培养至有再生芽从所述外植体切口处长出；(6)待所述再生芽长至3 4em时，用灭菌切片切下所述再生芽并移植到生根培养基上进行生根培养；(7)完整根系形成后，将该再生植株取出，并清洗去除附着在根系上的固体培养基，移植到珍珠岩中驯化，同时用重量体积比为I %的MS粉水溶液补充营养和水分，然后将所述植株移入土中继续生长。优选的，该方法还包括转基因番茄外源基因整合和转录后RNA的检测以及PGENE功能蛋白的提取。进一步优选的，所述转基因番茄外源基因整合和转录后RNA的检测包括以下步骤⑴待所述再生苗的3 4片真叶完全展开时，取其嫩叶用CTAB法抽提DNA，用PCR进行初步鉴定，同时回收特异PCR条带并测序，与目的基因PGENE的序列进行比对，初步确认PGENE基因在转基因番茄基因组中的整合；(2)将PCR检测阳性植株移入温室中培养，待再生植株10 12片真叶完全展开后用CTAB法提取叶片DNA，用于southern blot检测，确认植株外源基因整合和拷贝数；(3)在再生植株不同发育时期，分别提取经southernblot确认的阳性植株叶、花、青果(Mature Green, MG)和成熟果实(Yellow Ripe, YR)的RNA,用qRT-PCR技术构建外源PGENE在番茄植株中RNA水平表达情况(表达谱)，同时进一步确认靶基因组织特异性表达。所述PGENE功能蛋白的提取包括以下步骤(1)在转基因番茄果实成熟期取番茄果实，用研钵在液氮中研成粉末，然后转移至50mL聚丙烯离心管中，以 I I 的比例加入 1XPBS(KH2P040. 27g/L, Na2HPO4L 42g/L, KC10. 2g/L, NaC18g/L,PH = 7. 4) ； (2)上述溶液在冰浴过夜，13000rpm4°C离心30min ； (3)收集上清液；(4)按照BCA(Bicinchoninic acid)法进行总蛋白定量检测,先用BSA(bovine serum albumin)标准品通过梯度稀释制作标准曲线，分别取25 y L稀释后的标准品和各个蛋白样品加入到酶标板中，再将试剂盒中BCA试剂与cu+试剂50 I混合均匀后每孔加入200 u L该混合试剂，37°C温浴30min后用Bio-TEK(USA)酶标仪在0D562nm下测吸光值；(5)用ELISA方法对靶蛋白定量检测，并计算出目的蛋白PGENE占总蛋白的含量。优选的，所述发苗培养基的组分和各组分的质量百分比为MS粉为0.22%，蔗糖为3%，植物凝胶为0. 26%，余量为ddH20 ;该发苗培养基的pH值为5. 8。优选的，所述MS液体培养基的组分和各组分的质量百分比为MS粉为0. 44%，蔗糖为3%，余量为ddH20 ;该MS液体培养基的pH值为5.8。优选的，所述共培养培养基的组分和各组分的质量百分比为MS粉为0.44%，蔗糖为3 %，植物凝本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种诺如病毒P粒子PGENE基因，其碱基序列如SEQIDNO. I所示。2.一种表达载体,其特征在于,该表达载体包括如SEQIDNO. I所不的碱基序列。3.—种在番茄系统中表达PGENE功能蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 步骤一，PGENE基因表达载体的构建，所述构建的具体过程如下 (1)、用SpeI和BstEII双酶切含有PGENE基因的载体pUC57_PGENE，回收目标DNA片段，获得带有相应粘性末端的目的基因PGENE，同时利用SpeI和BstEII双酶切载体p2302-gfp,回收大片段，然后将两个所述片段连接并转化大肠杆菌DH5 a，得到中间载体P2302-PGENE ； (2)、用KpnI和SpeI双酶切中间载体p2302_PGENE，并用相同的酶切含有番茄果实特异性表达E8启动子全长的载体pMD18T-E8full2，回收目的DNA片段； (3)、将回收的所述目的DNA片段连接构成表达载体质粒，用PCR和测序两种方法鉴定所述表达载体质粒，在确认所述表达载体质粒中目的基因阅读框架正确无误前提下，将所述表达载体质粒用冻融法导入农杆菌中，获得包含PGENE基因表达载体质粒的农杆菌； 步骤二、所述包含PGENE基因表达载体质粒的农杆菌转化番茄，所述转化的具体过程如下 (1)将表面消毒的黄楼桃番爺22号种子播于MS发苗培养基上,取其小苗的下胚轴和子叶作为外植体进行遗传转化； (2)将所述包含PGENE基因表达载体的农杆菌于28°C摇菌培养至0D600= 0. 8 I. O时，室温6000rpm离心5分钟； (3)弃上清，菌体用MS液体培养基重悬，然后加入无菌外植体浸泡6分钟； (4)取出转化后的外植体，置于共培养基上，在25°C暗黑条件下共培养36小时； (5)共培养结束后将所述外植体转移到愈伤组织诱导培养基上，在25 28°C光照下培养，光周期为光照16h和黑暗8h，培养至愈伤组织形成，然后转到分化培养基上培养至有再生芽从所述外植体切口处长出； (6)待所述再生芽长至3 4cm时，用灭菌切片切下所述再生芽并移植到生根培养基上进行生根培养； (7)完整根系形成后，将该再生植株取出，并清洗去除附着在根系上的固体培养基，移植到珍珠岩中驯化，同时用重量体积比为1%的MS粉水溶液补充营养和水分，然后将所述植株移入土中...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵凌侠，杨桂华，王晓磊，李善爽，高美凤，高蕾，赵攀峰，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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