本发明专利技术公开了一种用于检测PCV‑2和PCV‑3的试剂盒、引物对、探针及方法。本发明专利技术试剂盒包括RT‑PCR反应体系，其包括引物探针混合液，所述引物探针混合液包括两引物对和两探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。该方法在闭管状态下进行扩增反应及产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性；探针杂交特异性更强、敏感性更高；PCR后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染；可同时实现PCV‑2和PCV‑3两种病毒的检测。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测猪圆环病毒2型和3型的试剂盒、引物对、探针及方法
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种用于检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和3型(PCV-3)的试剂盒、引物对、探针及方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus2,PCV-2)广泛存在于自然界中，对猪有很强的感染力，各种品种、年龄、不同性别的猪只均可感染。PCV-2主要侵害猪的免疫系统，降低机体的抵抗力和免疫应答反应，导致被感染的猪产生免疫抑制和其它病原微生物的继发感染。该病毒与猪群中发生的许多疾病关系密切，这些相关疾病统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。PCV-2在世界范围内广泛分布并且在猪群中存在至少有50多年，血清学和病原学调查己证实全世界范围内许多国家和地区的猪群均存在PCV-2感染，几乎100％的商品化养猪场感染过PCV-2，严重影响世界养猪业的发展。自2000年猪圆环病毒病首次在我国报道以来，除西藏、新疆、澳门未见报道外，其余各省、市、自治区均有PCV-2病毒分离和发生感染的报道。王佳慧利用PCR方法对中国16个省市75个规模化猪场2010-2011年间的688份样品进行检测，被检猪场PCV-2阳性率为58.67％。2016年美国学者Phan等报道了一种新的猪圆环病毒亚型-猪圆环病毒3型(Porcinecircovirus3,PCV-3)，携带该病原的猪呈现生长发育不良、心脏和多系统炎性浸润等病理变化，随后Palinski等也从表现皮炎肾病综合症的猪体内检测到了PCV-3，这些研究结果意味着新出现的PCV-3作为一种新的致病病原必须引起人们的重视。随后，中国、韩国、波兰、巴西等国家陆续报道了该病，表明该病已经在世界各地广为传播。2017年我国学者Deng等采用间接ELISA对我国猪群开展了PCV3的血清学调查，结果发现，2015-2017年间，我国猪群PCV3的感染率从22.35％上升到51.88％，表明PCV3已经在我国猪群流行和扩散，防控形势非常严峻。据报道，PCV-3可导致母猪厌食、皮炎肾病综合征、繁殖障碍，如流产、产木乃伊胎、死胎、弱仔等症状，其症状与PCV-2相似；由于PCV-3可从患有PDNS症状母猪及其流产胎儿体内检出，间接证明PCV-3具有垂直传播的特性；同时有研究表明该病毒可通过公猪精液传播。Fan等报道从湖北和广东发生繁殖障碍的母猪和急性死亡仔猪体内发现了该病毒。Shen等和Ku等报道表明我国已有13个省的猪群中都感染了PCV-3，主要分布在中东部地区。Ku等报道的通过普通PCR从辽宁、重庆3个猪场中的22份样品中发现，PCV-3和PCV-2单独感染率各为62.29％和34.7％，混合感染率为15.8％。鉴于PCV-3和PCV-2所引起的疾病症状非常相似，在临床上很难区分，且PCV-3呈现多地域感染的现状，建立快速、准确的鉴别PCV-3和PCV-2的方法是有效诊断和防控我国猪群感染PCV-3和PCV-2的基础。目前多有检测PCV-2或者PCV-3的单通道荧光定量PCR(郭慧娟,李秀丽,张国伟等.猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国畜牧兽医,2014,41(5):39-45.；张志,郝占武,张美晶,等.猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR方法的建立和应用[J].中国兽医科学,2018,48(065):686-691.)，然而其检出量高从而导致检测的敏感性较低，且每次仅能检出一种病毒，检测速度慢、效率低。尽管也有专利申请(CN108265126A)公开了可同时检测PCV-2和PCV-3的二重PCR检测方法，然而也存在检出度高(针对PCV-2和PCV-3的检出度分别高达508拷贝/μL和412拷贝/μL)而导致的敏感性较低的问题。因此，建立检测PCV-2和PCV-3的双重荧光PCR能够快速、准确的鉴别PCV-2和PCV-3的感染，为PCV-2和PCV-3感染的流行病学调查及监测提供切实可行的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服目前对PCV-2和PCV-3的检测基本都采用单通道荧光PCR方法或者二重PCR所具有的敏感性低、反应时间长等缺陷，而提供一种检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和3型(PCV-3)的试剂盒、引物对、探针及方法，在闭管状态下进行扩增产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性；探针杂交特异性更强；可同时实现PCV-2和PCV-3两种病毒的检测，大大缩短了检测时间，降低了检测成本；PCR后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染。因此，本方法特异性强、敏感性高、快速、安全，对样品中含微量PCV-2和PCV-3基因组的检测效果良好，可用于PCV-2和PCV-3的实验室检测和分子流行病学调查。双通道中通常含有两对以上的引物以及两个以上不同的探针，而根据本领域常识：同时使用的多个引物其在设计过程中需要兼顾不同引物的Tm值以及各个引物的特异性问题，还需要尽量避免多个引物的混合容易出现的引物之间形成二聚体的情况；不同探针的设计以及同时使用也存在类似的问题。而本专利技术的专利技术人在付出创造性劳动后，意外得到了特异性高、敏感性好且两对引物和与之同时使用的两个探针。为后续猪圆环病毒检测的发展提供了支点。本专利技术提供的技术方案之一是：一种用于检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪圆环病毒3型(PCV-3)的试剂盒，其包括PCR反应体系，所述PCR反应体系包括引物探针混合液，所述引物探针混合液包括两引物对和两探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。其中，序列如SEQIDNO.1和2所示的引物对用于检测PCV-2，序列如SEQIDNO3和4所示的引物对用于检测PCV-3，序列如SEQIDNO.5和6所示的探针分别用于检测PCV-2和PCV-3。为提高扩增效率，所述PCR反应体系中的引物的浓度较佳地分别为200～400nM，更佳地为200nM；所述探针的浓度较佳地为200～400nM，更佳地为400nM。较佳地，所述PCR反应体系还包括PCR反应液和Taq酶，所述PCR反应液包括Mg2+、dNTP以及PCR反应缓冲液，所述Taq酶为热启动Taq酶；其中，所述Mg2+的浓度较佳地为1～2.5mmol/L，更佳地为2.0mmol/L；所述dNTP的浓度较佳地为0.1～0.25mmol/L，更佳地为0.2mmol/L；所述PCR缓冲液较佳地为2×PCR缓冲液；所述热启动Taq酶的用量较佳地为0.1～0.5U/反应。在本专利技术一较佳实施例中，所述的引物探针混合液由所述两引物对和所述两探针组成，其中所述两引物对(包含两个上游引物和两个下游引物：PCV2-F、PCV3-F、PCV2-R和PCV3-R)中各引物的量为0.5μL、浓度为10μM；所述两探针中，各探针的量为0.5μL、浓度为10μM；所述PCR反应液由10μL2×PCR缓冲液、2μL25mM的MgCl2、1μL10mM的dNTP以及2μLDEPC-H2O组成，所述Taq酶为1μL5U/μL的Taq酶。更佳地，为了更直观、准确地判定检测结果，所述试剂盒还包括阳性对照和阴本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测PCV‑2和PCV‑3的试剂盒，其包括PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系包括引物探针混合液，所述引物探针混合液包括两引物对和两探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测PCV-2和PCV-3的试剂盒，其包括PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系包括引物探针混合液，所述引物探针混合液包括两引物对和两探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系中的引物的浓度分别为200～400nM，较佳地为200nM；所述探针的浓度为200～400nM，较佳地为400nM。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系还包括PCR反应液和Taq酶，所述PCR反应液包括Mg2+、dNTP以及PCR反应缓冲液，所述Taq酶为热启动Taq酶；较佳地：所述Mg2+的浓度为1～2.5mmol/L，更佳地为2.0mmol/L；和/或，所述dNTP的浓度为0.1～0.25mmol/L，更佳地为0.2mmol/L；和/或，所述PCR缓冲液为2×PCR缓冲液；和/或，所述热启动Taq酶的用量为0.1～0.5U/反应。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针混合液由所述两引物对和所述两探针组成，所述两引物对中各引物的量为0.5μL、浓度为10μM，所述两探针中，各探针的量为0.5μL、浓度为10μM；所述PCR反应液由10μL2×PCR缓冲液、2μL25mM的MgCl2、1μL10mM的dNTP以及2μLDEPC-H2O组成，所述Taq酶为1μL5U/μL的Taq酶。5.如权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为实时荧光定量PCR试剂盒；和/或，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有PCV-2和PCV-3目的基因序列的重组质粒，较佳地，所述阳性对照的浓度为3.1×106拷贝/μL；所述阴性对照为去离...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨德全，鞠厚斌，周锦萍，赵洪进，王建，葛菲菲，邓波，杨显超，李鑫，李凯航，葛杰，
申请(专利权)人：上海市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：上海,31
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