【技术实现步骤摘要】
携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗
本专利技术涉及一种携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗，该疫苗可进行基因转移、免疫和疫苗接种，属于生物
技术介绍
慢病毒是一种RNA病毒，属于逆转录病毒科，因其病毒颗粒中含有依赖RNA的逆转录酶而得名。慢病毒基因主要编码gag, pol和env3个基本的结构蛋白，以及4个辅助蛋白和2个调节蛋白。该科病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV),猴免疫缺陷病毒(SIV)，白血病病毒等，其中以HIV-I的研究最多，并在相关研究的基础上发展出慢病毒载体系统，被广泛应用于基因转导与基因表达等方面的研究[1-3]。慢病毒载体的构建的基本原理就是将HIV-I基因组中的顺式作用元件和编码反式作用因子的序列进行分离。整个载体系统由包装部分和载体部分构成包装部分去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，但能够反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体部分则含有包装、逆转录和整合所需的HIV-I顺式作用序列，并具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。载体包含的结构基因包括编码病毒的核心蛋白 的gag基因，基因编码病...
【技术保护点】
一种携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗，该疫苗具有在施用于动物时能同时产生体液和细胞免疫反应的药物用途，该假病毒外膜包含病原微生物的中和抗原，同时携带具有分子佐剂效应并能编码抗原的双链RNA。
【技术特征摘要】
I所述的重组表达质粒转染靶细胞后表达形成，除含有按要求插入病原蛋白编码序列外不含慢病毒核苷酸。所述的靶细胞包括BHK21、293、239T、Hela等来源于真核生物的传代细胞系。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合，它含有上述重组表达质粒表达的假型慢病毒颗粒和药学上可接受的佐剂或载体。在本发明的第四方面，提供了本发明的假型慢病毒颗粒的用途，用于制备预防和治疗丙型肝炎或流感的药物。在本发明的第五方面，提供了一种制备假型慢病毒颗粒的方法，包括以下步骤I)将权利要求I所述的含有病原微生物结构蛋白编码序列的重组表达质粒对靶细胞进行瞬时转染。2)当所述的祀细胞充分表达抗原结构蛋白时,收获细胞上清。3)将上清过滤去除细胞碎片后，采用蔗糖超速离心对病毒进行分离富集，亦可采用免疫亲和层析进行分离纯化。药物组合本发明所述的药用组合物可以包含实际使用时所选用的药学上可以接受的缓冲齐U，也包含用于预定用途的其它物质。本领域已有多种缓冲剂适用于预定用途，本领域的技术人员都善于选择的缓冲剂。在一些实例中，该药用组合可以含有药学上可接受的保湿齐U，药学上可接受的各种保湿剂在多种公开出版物都有叙述，包括如中华人民共和国药典(2010版)。所述的药用组合物可制备出各种剂型，如注射剂、片剂、丸剂、胶囊、喷雾剂等。适用于局部使用和口服的药用级别的有机或无机载体或稀释剂。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油脂。还可用稳定剂、乳化剂、维持PH值的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助材料。当本发明用作疫苗时，假型慢病毒颗粒疫苗可采用多种方法进行配制。通常情况下，按本领域熟知的各种方法，用药学上可以接受的载体或运载体配制本发明的疫苗。合适的药用载体包括无菌生理盐水，也可用其它无菌的水性和非水性的等渗注射液，是本领域技术人员熟知的药学上可接受的载体。配制本发明的疫苗组合物时还可含有其它成分，如佐剂、稳定剂、PH调节剂、防腐剂等。这些成分都是疫苗领域的技术人员所熟知的。佐剂包括(但不限于)铝盐佐剂、皂苷佐剂、CpG佐剂等。稳定剂包括(但不限于)精氨酸、乙基 纤维素、多元醇、氨基酸、无机盐、PEG等。给药途径与剂量当用作疫苗时，可用本领域技术人员熟知的方法将本发明的假型慢病毒颗粒疫苗施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径或模拟病毒感染的途径施用这些疫苗。采用疫苗组合物的形式时，除含有假型慢病毒颗粒外，还可包括药学上可以接受的载体、佐齐U、稳定剂、pH调节剂等。给药常规与途径包括肌肉注射、皮下注射、滴鼻、静脉注射、经口服等，如果需要也可采用组合给药途径。疫苗组合物的给用剂量可以单剂量，也可多剂量，且可给予加强剂量以维持被施用个体的免疫力。在所选用的给药途径中，应以有效剂量为给予假型慢病毒颗粒疫苗的量，足以引发被施用个体的免疫应答，能有效保护被施用个体抵抗目的病原微生物的感染。所述的有效剂量，是指在疫苗组合物中所选用的假型慢病毒颗粒疫苗的量是按可引发个体免疫保护性应答而无明显的副作用的量确定。本发明以疫苗组分中P24蛋白抗原的定量为基础计算有效剂量，该剂量包括例如相当于O. 5ng至5000ng p24抗原的载体颗粒。在小鼠中，优选剂量可为O. 5ng至50ng，而在马中优选剂量可为50ng至500ng。具体疫苗的最佳用量可通过实验免疫后观察对象的抗体滴度和其它反应来确定，通过检测疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量，施用佐剂或免疫刺激剂可提高本发明假病毒颗粒的免疫应答，这些都是本领域的技术人员所熟知的。本发明人经过深入的研究，建立了假型慢病毒颗粒疫苗制备技术，并快速制备获得了安全性好、免疫效价高的假型慢病毒颗粒疫苗，在此基础上完成了本发明。和现有技术相比，本发明具有以下优点I.提高了免疫的有效性假型慢病毒颗粒表面预免疫病原微生物的主要包膜蛋白成分，免疫宿主个体后可以产生对目的病原的免疫活性。并且由于假病毒的组织亲嗜性和感染过程与真病毒相同，因此可以模拟天然病毒的早期感染过程，有效刺激机体的免疫应答。2.提高了疫苗的安全性。[0032]本发明的假型慢病毒颗粒所含的核酸仅为单一抗原基因，为一过性表达，不具有复制和再度感染的能力，并且在载体构建过程中对载体的整合酶进行了功能缺失，极大的降低了载体随机整合的可能性，从而可以最大程度地降低疫苗使用的风险。3.操作简便，生产周期短。在构建了重组表达质粒后，转染细胞后收获上清，再经离心分离或过柱纯化即可获得该颗粒疫苗。步骤过程简单，从获得病原包膜蛋白基因到获得假型病毒颗粒，规范操作的周期仅为一周左右，并且扩增规模可以通过转染质粒量进行量化控制，非常适合应急病原疫苗的制备。附图说明图I :HCV假病毒颗粒包装系统的制备与鉴定a为包装质粒pCMVDR8. 2D64E的结构图示及，突变后测序结果山为转导质粒pCS(pCS-NS3为例)结构示意，及瞬时转染293T细胞后的表达鉴定结果；c为表达质粒PVRC-E1E2的结构示意，及瞬时转染293T细胞后的表达鉴定结果。图2 :HCV假病毒颗粒及其鉴定a为包装获得的假病毒颗粒结构示意图b为负染电镜显示的病毒颗粒形态；c和d为浓缩的病毒颗粒进行western blot鉴定E2，P24, NS3的结果。图3 =HCV假病毒疫苗免疫后的体液免疫反应测定a为单独采用HCV假病毒颗粒免疫，第二针与第四针免疫后采血检测的小鼠针对HCV E1，E2，NS3的特异性抗体水平；b为添加佐剂后第二，三，四针后检测的抗体水平。两者显示随着免疫次数的增加，抗体水平逐渐提高，而且不添加佐剂的抗体水平与添加组相似，说明本疫苗单纯免疫及有很好的免疫增强效果。图4 =HCV假病毒疫苗免疫后的细胞免疫反应测定采用ELISP0T检测HCV假病毒颗粒疫苗免疫四针后小鼠针对HCV El, E2，NS3的特异性T细胞免疫水平。具体实施方式下面以HCV假型慢病毒颗粒疫苗作为具体实施实例，对本发明进行阐明。应当指出，这些实例仅用于进一步阐明本发明，而不用于限制本发明的适用范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。实施例I :假病毒包装系统的制备I. I整合酶缺陷的包装质粒pCMVDR8. 2D64E的制备根据文献的报道，将包装质粒pHR’CMVA R8. 2中聚合酶区域第64位氨基酸D (GAT)突变为E(GAG)，可以使整合酶活性丧失，却不影响转导效率[17，18]。具体流程如下I)将pHR’ CMV Δ R8. 2质粒与含突变序列的pNL_IND64E质粒分别转化甲基化缺陷的E. coli K12细菌感受态2)质粒提取后均采用Sal I和Bcl I双酶切，切胶回收pHR’CMV Λ R8. 2中的IOkb片段和PNL-IND64E中的3. 4kb片段。[0046]3)将上述回收片段以I : 5的摩尔比例连接后转化DH5a感受态。4)提取质粒酶切鉴定后测序确认。I. 2转导质粒PCS-CG-NS3的制备及表达能力鉴定根据模板质粒PUC-H155序列设计引物，上下游引物各引入酶切位点。引物为NS3-5 : TCTGCTAGCTGGTGGTGCTGGATATCAT(NheI)；NS3-3 TCACTCGAGCATTAGGTCACCACTTCCA (XhoI)。将引物用无菌水稀释成 10 μ Μ,反应体系为pfx DNA polymerasel μ I, dNTP(2. 5m Μ)6 μ I, IOXAmp. buffer5 μ I,模板5叩，1^041111，引物各2111，模板5^，无菌水补足至5(^1。？0 反应条件为:94°C预变性5min ；94°C 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 2min，共 30 个循环；最后 72°C延伸 IOmin15PCR产物 经I %琼脂糖凝胶电泳检测大小，片段大小预期约为1900bp。切胶回收，取55μ1 Elutionbuffer洗脱,琼脂糖凝胶电泳估计浓度约为IOOng/ μ I。用NheI和XhoI分别酶切PCR产物和载体pCS_CG，酶切体系如下PCR产物(NS3) I. 5 μ g，酶 NheI 和 XhoI 各 I. 5 μ 1,10Xbuffer25y 1，BSA0. 5μ I，无菌水补至 50 μ I ；载体 pCS-CG 取 2μ g，酶 NheI 和 XhoI 各 2μ 1，10Xbuffer25y 1，BSAO. 5 μ I，无菌水补至50 μ I ;37°C酶切2h。I %琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。将回收的载体和片段于16°C连接过夜转化DH5a感受态，同时设载体对照和自连对照。连接产物转化后的单克隆菌落做菌落PCR初步鉴定正确后，提质粒酶切以及测序进一步鉴定其正确性。在经多克隆筛选及测序鉴定无误后，大量扩增获得超纯无内毒素质粒。取适量质粒对293T细胞进行瞬时转染后收集细胞进行Western Blot检测，通过特异性单克隆抗体检测可见在相应位置有明显的阳性条带(图lb)。按脂质体试剂说明书(Lipofectamine 2000, Invitrogen)转染 293T 细胞，具体方法如下I)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293FT细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为5X105细胞/ml，重新接种于25cm2细胞培养瓶，37°C、5% C02培养箱内培养。24h后待细胞融合度达70%-80%时即可用于转染。2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。3)向一灭菌离心管中加入所制备的各质粒溶液(pCMVDR8. 2D64E载体8 μ g，PCS-NS3质粒4 μ g. pCMV-CElE2质粒4 μ g)。与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为O. 3时，在室温下孵育5分钟。4)将 Lipofectamine2000 试剂轻柔摇勻，取 50 μ I Lipofectamine2000 试剂在另一管中与O. 3ml Opti-MEM混合，在室温下孵育5min。5)把稀释后的质粒与稀释后的Lipofectamine2000进行混合,轻轻地混勻后，室温孵育15min。6)将Li pofectamine2000与质粒混合液小心加入至293FT细胞的培养液中，混匀，于37°C、5% C02细胞培养箱中培养。7)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入5ml的pH值为7. 4的PBS液，轻轻洗去残余的转染混和物后倒去。8)每瓶细胞中加入5ml含10%血清的细胞培养基，于37°C、5%C02培养箱内继续培养48小时。收集细胞后，参照《分子克隆实验指南》的SDS-PAGE方法进行样品处理和电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，用小鼠抗NS3的单克隆抗体作一抗，IRdye-800cw标记的兔抗小鼠抗体(Licor公司)作二抗进行免疫印迹(Western blot)鉴定,有特异性抗原表达者为稳定转染细胞克隆。附图Ib显示了 Western blot鉴定结果,说明质粒能有效表达NS3蛋白。I. 3表达质粒PVRC-E1E2的制各在真核表达质粒pVRC的多克隆位点，将编码HCV包膜蛋白E1E2的基因序列插入。在经多克隆筛选及测序鉴定无误后，大量扩增获得超纯无内毒素质粒。取适量质粒对293T细胞进行瞬时转染后收集细胞进行样品处理和电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，用小鼠抗HCVEI,E2的单克隆抗体作一抗,IRdye-800cw标记的兔抗小鼠抗体(Licor公司)作二抗进行免疫印迹(Western blot)鉴定，有特异性抗原表达者为稳定转染细胞克隆。附图Ic显示了 Western blot的鉴定结果,说明质粒能有效表达HCV E1,E2蛋白。实施例2 =HCV假病毒颗粒的制备2. I细胞培养 采用含10 %胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco ' smodified Eagle medium, DMEM) (GIBCO)培养人 293FT 细胞。培养条件为 37°C>5% C02。细胞传代方法如下I)弃去旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻清洗细胞后弃去。2)加入Iml胰酶消化液，轻轻流过细胞后弃去，用残存液体消化细胞l_2min，直到细胞完全消化下来。3)加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养基5ml，用刻度吸管吹打，将瓶壁上的细胞冲洗下来。4)补加液体至10ml，混匀后分至两个新的培养瓶中，继续培养。细胞株的冻存I)取培养2-3天生长旺盛的细胞，用含90%胎牛血清和10%二甲基亚砜配成冻存液，将细胞配成2x106-2x107个/ml。2)在Iml细胞冻存管中加入Iml细胞悬液，混匀后密封。置4°C Ih, -20°C 2h，然后直接放入液氣中或直液氣蒸汽上过夜后浸入液氣中。细胞复苏I)从液氮罐中取出细胞冻存管。2)迅速放入盛有37°C温水的水浴中解冻。3)用70%酒精擦拭消...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭文杰，邓瑶，管洁，文波，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：
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