本发明专利技术公开了一种复合型治疗性乙肝基因疫苗及其构建方法。该DNA疫苗含有pIRES质粒、T-bet基因和HBV-L基因，T-bet基因和HBV-L基因分别位于pIRES质粒的IRES元件两侧的多克隆位点上，T-bet基因位于MCSA上，HBV-L基因位于MCSB上，T-bet基因和HBV-L基因的核苷酸序列分别如SEQ?ID?No.1和No.2所示，该DNA疫苗可用于预防和治疗乙型病毒性肝炎。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种乙肝疫苗，具体是指一种复合型治疗性乙肝基因疫苗，同时本专利技术也涉及这种疫苗的构建方法。
技术介绍
据统计，全球已有20多亿人经历HBV感染。疫苗接种是控制和预防乙型肝炎及其长期严重后遗症最有效的措施。自1997年世界卫生组织(WHO)推荐实施乙肝疫苗计划免疫以来，大范围的疫苗接种有效降低了 HBV感染率，然而HBV持续感染者仍超过3. 7亿，每年甚至有100多万患者死于急性或慢性HBV感染导致的肝硬化、肝功能衰竭和原发性肝细 胞癌。预防和治疗HBV感染迫在眉睫。目前，治疗乙型肝炎感染者两个难以解决的难题①肝内HBV长期存在并有不同程度复制，现有的抗病毒药物难以根除HBV ;②绝大部分病人对HBV及其抗原呈免疫耐受状态，使肝内HBV免受免疫杀伤，从而有利于病毒在肝内持续存在并复制。治疗性疫苗与传统意义上的预防性疫苗显著不同。预防性疫苗主要诱导机体产生体液免疫反应，而对病毒性疾病的研究发现，体液免疫并不能彻底清除细胞内感染病毒，只有细胞介导免疫反应，特别是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的细胞免疫反应才能发挥最根本的作用。进一步的研究表明细胞免疫所产生的CTL将在清除被感染细胞的过程中起到十分重要的作用。DNA疫苗作为20世纪90年代出现的一种新型治疗性疫苗，是一种含抗原基因的表达质粒，能全面地诱导特异性体液和细胞免疫应答。HBV DNA疫苗更是能打破其对HBsAg的免疫耐受，激发特异性CTL反应，有效地清除HBV，中止感染。Davis HL等研究证实，对小鼠和黑猩猩免疫接种PCMV_S2_S疫苗都能诱导产生抗-HBs、抗pre_S2抗体,还能产生对HBsAg的细胞免疫应答。Masanori Isogawa等研究表明，用表达HBsAg抗原的质粒DNA直接免疫小鼠，可有效诱导特异性血清抗体产生以及MHCI类限制性CTL应答，且该CTL应答在体内是由⑶4+、⑶8+效应细胞介导的。HBV DNA疫苗在注射部位被原位细胞摄取后，通过所含的启动子和增强子系统调节相应靶蛋白的合成。靶蛋白被分解为肽段，肽段表位与β2微球蛋白和主要组织相容性复合体(MHC) I类分子形成三聚体.递呈并激活CD8+T效应细胞；或靶蛋白通过血运和(或)淋巴循环系统汇集于淋巴结或脾脏中，为“专业”抗原递呈细胞(APC)所吞噬，经与MHC II类分子结合.激活⑶4+和Th细胞，Th细胞激活B效应细胞(Be)和B记忆细胞(Bm)，Be将在骨髓中形成生发中心，长期生成特异性抗体，Bm可诱导T记忆细胞(Tm)的产生，而Tm则作为潜在的CTL，保存在循环库中。由于DNA疫苗表达的蛋白质可作为内源性抗原被递呈，故具有传统疫苗所不具备的优势，即能够有效地诱导机体CTL的细胞免疫应答。研究表明，DNA疫苗诱生的CTL可识别和溶解体内感染HBV的细胞，特别是此种CTL可分泌IFN- Y，并可抑制感染细胞内的病毒复制或清除病毒而不引发细胞损伤。此夕卜.HBV DNA疫苗因可启动有效的抗原提呈途径.促进机体合成内源性抗原，提呈相关表位。大量产生CD8+CTL细胞,所以这类疫苗也可以作为治疗慢性乙型肝炎患者的候选物。T-bet,也称Tbx21，系2000年哈佛大学Szabo等发现的一种重要的Thl细胞转录因子，为T-box家族的新成员，是IFN-Y基因强有力的转录激活剂，又能诱导并保持IL-12Ri3 2的表达，且能将分化中的效应性Th2和已完全分化的Th2逆转为Thl，伴随产生大量的IFN-Y，并抑制IL-4、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子的产生，从而影响机体的免疫应答。·
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可在PlRES中共表达乙肝表面抗原大蛋白HBV-L和免疫佐剂T-bet蛋白的基因疫苗及其构建方法。本专利技术采用的技术方案为一种复合型治疗性乙肝基因疫苗，含有PlRES质粒，T-bet基因和HBV-L基因，其中Τ-bet基因和HBV-L基因分别位于pIRES质粒上的IRES元件的两侧；其中，pIRES为商业性的质粒，含有多克隆位点A(MCSA)，多克隆位点B(MCSB)和IRES元件，MCSA和MCSB分别位于IRES元件的两侧，T-bet基因位于MCSA上，HBV-L基因位于MCSB上。所述复合型治疗性乙肝基因疫苗构建方法包括以下步骤(I)RT-PCR 法克隆人 T-bet 基因，人 T-bet 基因与 pMD18-T Simple Vector 进行连接，构建一个亚克隆载体pMD18-T/T-bet，然后用Nhe I、EcoR I从pMD18-T/T_bet载体上切下T-bet目的片段基因，与载体pIRES连接构建pIRES/T-bet。(2)以 pCDNA3. I (_)/HBV-L 为模板 PCR 扩增出 HBV-L 基因，HBV-L 基因与 pMDl8-TSimple Vector进行连接，构建一个亚克隆载体pMD18-T/HBV-L，然后用Sal I、Not I从PMD18-T/HBV-L载体上切下HBV-L基因片段，与构建完成的pIRES/T-bet连接，得到复合型治疗性乙肝基因疫苗。本专利技术与现有的技术相比，具有如下优点和有益效果(I)采用pIRES双顺反子真核表达载体，两段基因各自表达，不影响彼此空间结构。(2)首次采用转录因子T-bet作为免疫佐剂，T-bet是Thl细胞特异性的转录因子，促使ThO细胞向Thl细胞分化，并且能逆转Th2细胞向Thl细胞转化，所产生的Thl型免疫应答，能更好的清除胞内病毒。(3)采用HBV-L作为抗原基因，由于乙肝病毒表面抗原基因的易突变性，采用传统的乙肝疫苗即乙肝表面抗原小蛋白进行免疫时，部分人群不能产生保护性的抗体。由于presl抗原、pres2抗原在HBV与肝细胞相应受体的粘附中起重要作用,但是包含presl抗原、pres2抗原的乙肝表面抗原大蛋白免疫机体时,就可以产生针对presl抗原、pres2抗原的特性抗体，这些抗体具有良好的中和病毒的作用，并且乙肝表面抗原大蛋白相比乙肝表面抗原小蛋白，具有更多抗原表位，降低了免疫后不产生保护性抗体的几率。以下将结合附图和实施详例说明本专利技术，应当说明的是，实施例是对本专利技术的技术方案的进一步说明，但并不表明本专利技术仅限于这些实施例。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图I复合型治疗性乙肝基因疫苗pIRES-T-L构建流程2T_bet、HBV-L基因扩增产物电泳3亚克隆载体pMD18-T/T_bet、pMD18-T/HBV_L限制性酶谱分析图4复合型治疗性乙肝基因疫苗限制性酶谱分析具体实施例方式I. PCR引物设计与合成设计2对引物，分别作为扩增T-bet、HBV_L的引物序列，引物序列和酶切位点见表 I。扩增的T-bet、HBV-L基因片段大小分别为1608bp，1203bp。引物均由invitrogen公司合成。目的基因扩增引物序列基因编号引物酶切位点 Pl(up) 5，-ATAGCTAGCATGGGCATCGTGGAGC-3，Nhe \'6P2(down) 5’-CCGCCGTGAATTCTCAGTTGGGAAAATAG-3 ’EcoR IHBVLP3(UP) 5，-GCGTCGACAGCATGGGAGGTTGGTCTT-3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种复合型治疗性乙肝基因疫苗，其特征在于含有pIRES质粒，T?bet基因和HBV?L基因，其中T?bet基因和HBV?L基因分别位于pIRES质粒上的IRES元件的两侧；其中，pIRES为商业性的质粒，含有多克隆位点A(MCSA)，多克隆位点B(MCSB)和IRES元件，MCSA和MCSB分别位于IRES元件的两侧，T?bet基因位于MCSA上，HBV?L基因位于MCSB上；所述T?bet基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述HBV?L基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林绍强，晏永波，李晓霞，刘乃华，成军，
申请(专利权)人：林绍强，晏永波，李晓霞，
类型：发明
国别省市：
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