一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗及其构建方法。本发明专利技术的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗，由RHDV-VP60基因和甲病毒复制子载体pSCA组成。该DNA疫苗的构建方法包括：RHDV病毒总RNA的提取及纯化，设计特异性引物，通过RT-PCR扩增，克隆得到RHDV-VP60的cDNA基因序列，去掉RHDV-VP60氨基端31个氨基酸，最后将纯化后的VP60cDNA片段重组到甲病毒复制子载体pSCA真核表达质粒中。与现有技术相比，本发明专利技术的疫苗安全高效，并可随细胞凋亡而被机体清除，从而避免DNA质粒可能整合到宿主细胞染色体或可能造成免疫耐受等隐患，且更长效稳定，操作便捷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物病毒学与动物传染病学
，特别涉及一种兔出血症病毒“自杀性” DNA疫苗及其构建方法。
技术介绍
兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)俗称“兔痕”,是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种急性高致死性兔传染病。本病具有病死率高、死亡快，而且传播迅速等特点，对养兔业的健康发展造成了严重威胁，因而被国际兽疫局正式列为“国际动物保健编目” B类传染病，我国农业部也将之列为二类动物疫病。1984年初，刘胜江等在我国江苏无锡首次发现兔瘟以后，本病迅即蔓延到我国25省市、自治区，其后，世界各地如墨西哥及欧洲的许多国家也有类似兔瘟流行，给养兔业造成了巨大经济损失。RHDV的衣壳蛋白为病毒的主要结构蛋白，称VP60。该蛋白是RHDV的主要结构蛋白，VP60构成的立体结构衣壳由180个完全相同的亚基组成，亚基之间相互作用然后形成具有三维构象的衣壳。该组装过程与各个亚基的N端序列有关，因为将该区段缺失后，VP60就再不能装配成空衣壳。RHDV在宿主细胞中完成一个复制周期后，由VP60组装的空衣壳将子代RNA包裹形成成熟的病毒粒，然后随着细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗，其特征在于，该疫苗由RHDV？VP60基因和甲病毒复制子载体pSCA组成，其中，所述RHDV？VP60基因去掉了氨基端的31个氨基酸，其序列如SEQ？ID？NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗，其特征在于，该疫苗由RHDV-VP60基因和甲病毒复制子载体PSCA组成，其中，所述RHDV-VP60基因去掉了氨基端的31个氨基酸，其序列如SEQ ID NO 1所示。2.一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括如下步骤 1)以发病兔内脏组织为原料进行RHDV病毒总RNA的提取；同时设计如下两个特异性引物PSCA-VP60F :5，ATTGGATCCteanffl DGCCACCATGGGCGTGGTGGCCGC-3，，PSCA-VP60R :5’ AGACCCGGGuTCAGACATAAGAAAAGCC-3，； 2)以病毒总RNA为模板，使用反转录方法，以PSCA-VP60R为反转录引物合成PSCA-VP60的cDNA第一链，之后用特异性引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R进行PCR扩增，得到缺失氨基端31个氨基酸的VP60基因，并用试剂盒纯化回收； 3)将扩增的RHDV-VP60基因片段重组到甲病毒复制子载体pSCA真核表达质粒中，即得到兔出血症病毒“自杀性” DNA疫苗。3.根据权利要求2所述的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤I)中，RHDV病毒总RNA的提取方法为将RHDV病毒肌肉注射两月龄的新西兰大白兔，待新西兰大白兔死亡后，取其肝脏制备研磨液，按常规方法提取RHDV病毒总RNA。4.根据权利要求2所述的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述的反转录方法为 用反转录试剂盒进行转录，反转录体系为=IOXBuffer 2 μ L、RNA/引物变性溶液6 μ L>2. 5mM dNTP Mixture 2 μ L、RNase Inhibitor 0. 25 μ L> RTaseM-MLV 0·5μ ,加灭菌蒸馏水9. 25 μ L，使反转录体系体积为20 μ L，其中所述的RNA/引物变性溶液制备方法为RNA模版5 μ L和特异性引物PSCA-VP60R I μ L在70°C水浴lOmin，冰上冷却2min ;反转录过程为将提取的RHDV-VP6042°C温...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光清，程英杰，孟春春，陈宗艳，李传峰，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：