本发明专利技术涉及一种人源dcf1基因在抑制U251胶质瘤细胞系增值和诱导U251胶质瘤细胞系凋亡中的应用。本发明专利技术通过免疫电镜、原子力显微镜、CCK8增殖检测、JC-1染色、裸鼠肿瘤异位移植等方法对dcf1诱导U251细胞系凋亡做出判断，结果表明dcf1通过定位于线粒体引起线粒体结构病变，膜电位下降，从而引起凋亡相关基因表达量发生改变，最终导致凋亡。裸鼠实验表明，dcf1能显著减小胶质瘤的肿瘤体积，抑制肿瘤生长。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及了一种人源而/7的新用途。特别是人源而/7基因在脑胶质瘤细胞的抑制与凋亡中的应用。
技术介绍
脑胶质瘤(glioma)是由神经外胚层分化而来的胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜等)发生的肿瘤。胶质瘤在颅内肿瘤中发病率位于第一位，约占45%左右。胶质瘤的治疗问题是神经外科中较为棘手的一个问题，由于其死亡率高，预后较差，无法控制的细胞增殖、细胞凋亡减慢，肿瘤细胞侵袭性强等使肿瘤的治疗面临巨大的困难，患病后手术加放化疗的平均生存期仅为8 11个月。目前肿瘤治疗主要有以下几种方法手术治·疗、化学药物、治疗放射治疗、光动力治疗。但这四种治疗方法对大脑损伤性大，易复发，对患者机体消耗大，也无法起到根治目的。树突状细胞因子(dendritic cell factor I, dcfl)又名跨膜蛋白59(transmembrane protein 59,是单次跨膜蛋白。根据基因芯片GDS2853分析显示，随着胶质瘤级别的升高，dcfl基因表达量呈现下调状态。同时，dcfl基因敲除小鼠基因芯片和蛋白芯片表明，敲除而/7后，贫/每7 (胶质细胞标记物)表达量上调。2008年Wang，L; et al研究证明，在神经干细胞中，过量表达而/7，可维持神经干细胞未分化状态，而沉默ofc/7则能促进神经干细胞的分化。2012年Li, X; et al通过小分子microRNA-351,下调而/7的表达后，神经干细胞系C17. 2向胶质方向分化。以上结果都表明，而/2表达量下调可能促进胶质细胞发生。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种人源而/2基因在诱导U251胶质瘤细胞系凋亡中的应用。本专利技术的目的之二在于提供人源i/c/7基因在抑制U251胶质瘤细胞系增值中的应用。本专利技术的目的之三在于提供人源而/2基因在抑制肿瘤生长中的应用。技术方案本专利技术通过培养U251胶质瘤细胞系，运用Lipofectamine 2000Transfection Reagent阳离子脂质体转染法，在U251细胞中分别转染pEGFP_N2和PEGFP-N2-DCF1，使其分别表达EGFP绿色荧光蛋白和EGFP-DCF1融合蛋白，前者作为对照。发绿色突光的融合蛋白可指示ofc/V在细胞中的分布，进一步运用ofc/V —抗和胶体金二抗，可在电镜下观察胶体金颗粒，从而确定其亚细胞定位。通过CCK8试剂盒，检测细胞增殖能力。JC-I染料检测细胞线粒体膜电位。电镜和原子力显微镜观察线粒体外观，判断线粒体是否发生病变。Western检测过表达而/7后凋亡相关蛋白表达量是否发生变化，从而在凋亡机制上做初步探索。运用裸鼠肿瘤异位移植技术，在体内层面判断而/7基因对胶质瘤的治疗作用。本专利技术通过免疫电镜、原子力显微镜、CCK8增殖检测、JC-I染色、裸鼠肿瘤异位移植等方法对而/7诱导U251细胞系凋亡做出判断，结果表明dcfl通过定位于线粒体引起线粒体结构病变，膜电位下降，从而引起凋亡相关基因表达量发生改变，最终导致凋亡。裸鼠实验表明，而/7能显著减小胶质瘤的肿瘤体积，抑制肿瘤生长。附图说明 图I为-.dcfl基因扩增及重组质粒PEGFP-N2-DCF1酶切鉴定。A图为以Hela细胞cDNA为模板，通过PCR法扩增获得人源dcfl基因片段，全长972bp。图中最左边泳道为DNAMarkerCSM#0311),泳道I为dcfl基因PCR后扩增产物。B图为重组质粒pEGFP_N2_DCFl酶切鉴定图。泳道I为空载PEGFP-N2经EcoRI单酶切，2_5为阳性克隆经EcoRI和BamHI双酶切后释放出目的条带ifc/i(972bp)及空载片段(4700bp)。表明重组质粒pEGFP_N2_DCFl构建成功，经测序验证正确后用于后续实验方案。图2为U251细胞系中转染重组质粒PEGFP-N2-DCF1。EGFP-DCFI融合蛋白(图A, C)呈现核外点状分布，B图为DAPI细胞核染色，E图DCFl蛋白免疫荧光，C图为A图与B图叠加。F图为D图与E图叠加。(放大倍数200倍；标尺50um) 图3为EGFP-DCF1融合蛋白与线粒体染料MitoTracker-Red共定位。EGFP-DCF1融合蛋白(图A)与线粒体(图B)存在共定位，C图为A图与B图的叠加。图4为'dcfl基因可定位于线粒体。Western检测转染重组质粒pEGFP_N2_DCFl的U251细胞系线粒体中有DCFl蛋白的存在(图A)。DCFl免疫电镜观察发现在转染重组质粒pEGFP-N2-DCFl的U251细胞系线粒体处有少量胶体金被标记(图B)。(放大倍数20000倍；标尺500nm) 图5为在胶质瘤细胞系中过量表达可抑制细胞增殖能力。U251细胞系过量表'lkdcfl引起细胞增殖能力下降，细胞皱缩(图A)，从左至右依次为对照组，转染空载质粒PEGFP-N2组，转染重组质粒pEGFP-N2-DCFl。CCK8检测表明dcfl能极显著降低U251细胞增殖能力(图B)，同时也表明dcfl能显著降低U87MG细胞系增殖能力，但其抑制效果比U251稍差(图C)。但i/c/7基因过量表达对K562，H1299，Hek293T细胞系增殖能力未有影响。*，Ρ〈0· 1;**，Ρ〈0·05，***，Ρ〈0·001。(放大倍数100 倍；标尺 200um) 图6为过量表达可引起U251细胞系线粒体膜电位下降。U251细胞系经线粒体电子传递链抑制剂CCCP处理后，线粒体膜电位下降，JC-I无法聚集，呈现绿色(图A)。对照组线粒体膜电位正常，JC-I聚集体呈红色(图B)。转染空载质粒pEGFP-N2组，JC-I也呈现红色，大块绿色为EGFP发光(图C)。转染重组质粒PEGFP-N2-DCF1 48小时候，JC-I主要呈现绿色，与药物处理组相似(图D)，说明过表达而/7后，U251细胞线粒体膜电位发生下降。(放大倍数100倍；标尺200um) 图7为过表达而/7引起U251细胞线粒体肿胀，最终引起细胞凋亡。(A，D，G)图为对照，(B，E，H)图为U251细胞转染空载对照pEGFP-N2，(C，F，I)图为U251细胞转染重组质粒PEGFP-N2-DCF1。(A-C)图为透射电镜观察U251细胞结构。对照与空载组细胞结构完整，核仁清晰可见(图A，B);实验组细胞核裂解，胞质中出现大量空泡状结构，并包含数个自噬体存在，呈现典型凋亡特征(图C)。(D-F)图为透射电镜观察细胞线粒体结构形态。对照与空载组线粒体结构完整，可见嵴结构存在(图D，E);实验组中多个线粒体发生严重肿胀，嵴发生破裂，存在严重病变(图F)。(G-I)图为原子力显微镜观察抽提的U251细胞线粒体。对照与空载组线粒体尺寸在600nm左右，表面光滑(图G，H);实验组线粒体发生肿胀，尺寸在1600nm左右，且线粒体外膜呈现多孔状结构，这与线粒体通透性孔开放有关，表明线粒体功能发生异常(图I)。图8为调亡相关重要蛋白Western检测。结果表明，过表达t/c/7后,调亡关键蛋白procaspase-3酶被剪切成有活性的形式(17kD，19 kD)，抑凋亡基因Bcl_2表达发生下调，促凋亡基因Bax表达上调。从机制上对而/2引起U251本文档来自技高网...
【技术保护点】
人源dcf1基因在诱导U251胶质瘤细胞系凋亡中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：文铁桥，谢雨琼，杨眉，杨清波，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。