本发明专利技术涉及一种破伤风外毒素中和性B细胞抗原表位肽与应用，本发明专利技术通过重叠截短法分段构建破伤风外毒素C片段抗原，采用Western?Blot方法，筛选出单克隆抗体TT5C4所识别的B细胞抗原表位所在区域，并对B细胞表位肽的免疫保护性进行了鉴定，本发明专利技术的B细胞表位肽可用于破伤风的肽疫苗研究和利用B细胞表位肽制备特异的单克隆抗体以用于诊断和预防破伤风。本发明专利技术的B表位肽可以用来研制人或小鼠用的破伤风肽疫苗，可以用来开发预防破伤风多肽药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药生物
，尤其涉及破伤风外毒素B细胞表位肽的应用。
技术介绍
破伤风(tetanus)是破伤风杆菌经伤口入侵人体产生的外毒素(tetanus toxin,TT)所致的一种致死性、急性感染性疾病。破伤风外毒素是一种神经毒素，可导致患者因肌肉痉挛所致的张口困难、持续性的全身肌张力增高和阵发性强直性肌痉挛，患者最终因喉痉挛、呼吸衰竭致死。此病发病急、进展快，死亡率可高达20% 50%。目前破伤风仍然是严重的全球性公共卫生问题。据不完全统计全世界每年约有 超过21. 3万人死于破伤风，我国的破伤风死亡率高于世界平均水平。在一些贫困地区，因不洁分娩导致的母婴感染破伤风的事件时有发生；近年来，频发的各类自然灾害和意外伤等导致伤者因破伤风致死的危险也显著增高；此外，随着科学技术的发展，在体外采用基因工程技术大量合成生产破伤风外毒素已经成为可能，因此破伤风外毒素很可能成为一种潜在的生物战剂，被恐怖分子利用制造生物恐怖。破伤风的预防和治疗主要依赖于抗体，并且只能通过主动免疫(破伤风疫苗)或被动免疫(抗破伤风外毒素抗体)实现。研究表明破伤风外毒素蛋白分子量为150kDa。毒素经菌体释放后，在蛋白水解酶的作用下，被“裂解”成一条轻链(50kDa)和一条重链(IOOkDa)，但轻链和重链之间仍有二硫键相连。轻链是锌依赖蛋白酶，通过水解突触囊泡蛋白-2来阻断神经抑制性介质的释放。C蛋白片段是重链的一部分，分子质量为50kDa，不具备神经毒素的活性，却保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质，是毒素的保护性抗原。由于C蛋白片段是破伤风毒素的非毒性片段，且有较高的免疫原性，因此是制备破伤风疫苗和抗破伤风中和性抗体的理想抗原。表位肽疫苗是目前新型疫苗研究的重要方向。筛选具有中和作用的破伤风外毒素中和性B细胞抗原表位肽，对研究更加高效的新型破伤风疫苗具有重要意义。本研究小组前期已经制备了一株特异针对破伤风毒素C片段的单克隆抗体TT5C4(产生单克隆抗体TT5C4的杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC :C201257)，经动物实验证实这株单克隆抗体具有阻断破伤风外毒素毒性的功能。利用具有中和活性的单克隆抗体靶向性筛选中和性B细胞表位肽，具有准确、高效的特点。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供I. 一种来自破伤风外毒素中和性B细胞抗原表位肽，该表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。本专利技术第二个目的是提供上述的来自破伤风外毒素中和性B细胞抗原表位肽在制备预防破伤风的药物组合物中的应用，其可用于制备预防破伤风的药物组合物，或制备单克隆抗体。本专利技术所述的预防破伤风的药物，其包含上述的来自破伤风外毒素中和性B细胞抗原表位肽和药学上可接受的载体，其中所述的药学上可接受的载体包含稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体中的至少一种。如本专利技术的B细胞表位肽可以与佐剂KLH —起组成药物制剂后口服，与mi—起组成药物制剂静脉输注射。本专利技术所述的另外一种预防破伤风的疫苗，其也包含上述的来自破伤风外毒素中和性B细胞抗原表位肽。以本专利技术所述的能有效阻断破伤风外毒素毒性作用的抗破伤风外毒素C片段(fragment C of tetanus toxin, TTC)单克隆抗体TT5C4为基础，以BALB/c小鼠为动物模型，制备了在BALB/c小鼠动物模型上研究的预防破伤风的表位嵌合疫苗。首先应用生物信 抗原进行6个片段重叠截短设计，分别命名为Cl 111、C103 290、C178 307、C254 451、C291 451、C308 451采用基因工程技术对截短片段进行分段构建表达，然后采用Western Blot方法鉴定出单克隆抗体TT5C4所识别的破伤风外毒素C片段上的B细胞抗原表位所在区域；通过人工肽合成技术合成B细胞抗原表位肽并偶联载体蛋白钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin, KLH)构成表位嵌合疫苗后免疫动物,检测抗体效价鉴定其免疫原性，再用致死剂量的天然破伤风外毒素对免疫动物攻毒，以鉴定B细胞抗原表位肽的免疫保护作用。本专利技术通过重叠截短法分段构建破伤风外毒素C片段抗原，采用Western Blot方法，筛选出单克隆抗体TT5C4所识别的B细胞抗原表位所在区域，并对B细胞表位肽的免疫保护性进行了鉴定，本专利技术的B细胞表位肽可用于破伤风的肽疫苗研究和利用B细胞表位肽制备特异的单克隆抗体以用于诊断和预防破伤风。本专利技术的B表位肽可以用来研制人或小鼠用的破伤风肽疫苗，可以用来开发预防破伤风多肽药物。所述单克隆抗体TT5C4杂交瘤细胞株已于2012年4月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. C201257，细胞株名称鼠源杂交瘤细胞株TT5C4。 为让本专利技术的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。附图说明图I. DNASTAR软件对破伤风外毒素C片段(TTC)氨基酸序列的分析2. TTC截短片段示意3. PCR扩增6个段基因M. DNA 分子 Marker泳道I. TTC截短片Cl IllPCR扩增产物泳道2. TTC截短片C178 307PCR扩增产物泳道3. TTC截短片C308 45IPCR扩增产物泳道4. TTC截短片C254 45IPCR扩增产物泳道5. TTC截短片C103 290PCR扩增产物泳道6. TTC截短片C291 45IPCR扩增产物图4. 6个TTC截短片段的重组表达质粒的双酶切鉴定M. DNA 分子 Marker泳道I. TTC截短片重组表达质粒PET22b_Cl lllNdel/XhoI双酶切鉴定泳道2. TTC截短片重组表达质粒PET22b_C178 307NdeI/XhoI双酶切鉴定泳道3. TTC截短片重组表达质粒PET22b_C308 451NdeI/XhoI双酶切鉴定泳道4. TTC截短片重组表达质粒PET22b_C254 451NdeI/XhoI双酶切鉴定泳道5. TTC截短片重组表达质粒PET22b_C103 290NdeI/XhoI双酶切鉴定泳道6. TTC截短片重组表达质粒PET22b-C291 451NdeI/XhoI双酶切鉴定 图5. PAGE鉴定6个TTC截短片段的重组蛋白工程菌的表达M.蛋白分子 Marker泳道I. IPTG诱导空质粒PET22b/BL21重组工程菌溶菌上清泳道2. IPTG诱导PET22b_Cl 111/BL21重组工程菌溶菌上清泳道3. IPTG诱导PET22b-C178 307/BL21重组工程菌溶菌上清泳道4. IPTG诱导PET22b-C308 451/BL21重组工程菌溶菌上清泳道5. IPTG诱导PET22b-C254 451/BL21重组工程菌溶菌上清泳道6. IPTG诱导PET22b_C103 290/BL21重组工程菌溶菌上清泳道7. IPTG诱导PET22b-C291 451/BL21重组工程菌溶菌上清图6. Western Blot鉴定单克隆抗体3B9所识别的B细胞抗原表位A.单克隆抗体3B9所识别的B细胞抗原表位区域示意图B. Western Blot鉴定单克隆抗体3B9所识别的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来自破伤风外毒素中和性B细胞抗原表位肽，其特征在于：该表位肽的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗萍，邹全明，毛旭虎，顾江，秦利燕，陈立，余抒，刘唯，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，重庆原伦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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