一种细菌外毒素的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种细菌外毒素的生产方法，包括细菌及产毒培养、细菌外毒素的提取、纯化、保藏工序，细菌的产毒培养是在微生物透析培养器中进行，微生物透析培养器包括培养基室和培养室，培养基室和培养室之间设置有透析膜及支撑保护透析膜的装置，培养基室的容积与培养室的总容积之比根据微生物的培养时间的长短在３∶１到１∶６之间选定，微生物的生长所需要的设施设置在培养基室中；其生产方法包括产毒培养、除菌过滤、浓缩沉淀、透析结晶、保藏工序。采用本发明专利技术的方法生产毒素，优化细菌生长环境，简化了细菌外毒素的浓缩、提纯工艺，其收获率可以由原来的１７％～３３％提高到了９０％，提纯时间由原来自然透析的１２～１５天缩短为１２～２４小时左右。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微生物的制备方法，尤其是指一种细菌外毒素的培养、提 取、浓缩、纯化的工艺方法。
技术介绍
细菌外毒素是细菌生长过程中从菌体内代谢出来的一种大分子蛋白。这些 大分子蛋白具有各种毒力。目前细菌外毒素已在医学、灭害等许多领域得到应用，如C型肉毒梭菌菌苗、类毒素已应用到预防医学领域，1989年美国FDA正 式批准A型肉毒毒素作为新药投产上市。目前A型肉毒毒素已应用到临床医学 和美容除皱领域，如可以用于神经科、眼科等领域的肌张力障碍性疾病——眼 睑痉挛、面肌痉挛、斜视及痉挛性斜颈等的治疗，B型、E型肉毒毒素也已经进 入临床试验，C型D型肉毒毒素可以用来灭鼠，苏金云杆菌正在灭苍蝇蚊子方面 试用。最近国际上已经开始破伤风杆菌毒素的应用实践。细菌外毒素还可以应 用于国防建设。目前流行使用的细菌培养方法是传统的发酵法。它是将菌种直接接种于培 养基中，细菌在培养基中生长繁衍，培养时培养基、细菌及细菌的外毒素混合 在一起，细菌在具有营养物、排泄物的混合环境中生长。如果需要单纯的外毒 素就必须采用分离的技术手段将细菌外毒素从混合体中分离出来。这样的培养 及提纯方法不但细菌及外毒素的产量低、收获率小，而且提纯工艺复杂。由于 细菌的生长环境不好，因此细菌的质量也不高。目前美国制备A型肉毒毒素的 工艺是包括肉毒梭菌全培养酸沉淀一一毒素磷酸盐緩冲液提取一一硫酸铵浓 缩及自然结晶等步骤。这种方法在工艺时间、消耗、收率等方面存在着一定的 问题。中国专利97118838. 6也公开了一种A型肉毒结晶毒素的生产工艺及生产该毒素所需的冻干保护液，该专利技术的工艺为产毒培养基-产毒培养-除菌过 滤-毒素的精制提纯-毒素的稀释、冻干。其主要技术方案包括用酪蛋白、 胰酶粉、酵母透析液、蒸馏水、葡萄糖制作培养基的过程，产毒的培养、 除菌过滤、毒素的精制提纯、毒素的稀释冻干等工序。其收取的毒液是培 养基和细菌外毒素的混合液，其工艺步骤中必须包括酶化、透析、层析等 步骤，才能把细菌外毒素从毒液中分离出来。1896年俄国人梅尼契诃夫专利技术了培养细菌的新方法一一透析培养法。透析 培养是用透析膜将培养基和培养物分开，细菌、培养物所在的部分叫培养室， 培养基(即养份)所在的部分叫培养基室，培养物通过培养室和培养基室之间 的透析膜吸取培养基的养份，而培养物的小分子排泄物又通过透析膜进入培养 基室。因此净化了细菌的生长环境。但是透析法一直束之高阁，只是在实验室 内使用，无法工业化生产，主要原因是透析法一直使用嚢袋式的透析器，将透 析嚢袋浸泡于培养基液中，透析嚢袋处于自由状态，由于存放培养物的透析囊 袋在培养基中浸泡、移动等原因，囊袋容易破裂。而且其要求培养基所占的体 积是培养物所在体积的IO倍，也就是说一般的透析培养法的透析比为10: 1。 而透析嚢袋的体积不可能做的太大，否则更容易破损。所以透析法虽然可以获 得高活性高质量的细菌及其衍生物，但由于成本高、成功率低，很少有人使用。虽然后来透析培养法经过了部分改进，但仍然沿用培养基比培养物为10: 1的 透析培养比。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供 一种能够高效、稳定的生产高品质细菌 外毒素的方法。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是，包括细菌及产毒培养、细菌外毒素的提取、 纯化、保藏工序；其生产方法包括如下步骤 A、产毒培养细菌的产毒培养是在微生物透析培养器中进行，微生物透析培养器包括培 养基室和培养室，培养基室和培养室之间设置有透析膜及支撑保护透析膜的装 置，培养基室为一个，培养室装配培养基室上，培养室的数量是培养基室的倍数，培养基室的容积与培养室的总容积之比根据微生物的培养时间的长短在3: l到l: 6之间选定，微生物的生长所需要的设施设置在培养基室中，由培养基 室为微生物提供生长条件，以确保培养室优良的生长环境；微生物透析培养器 的形状应采用立体几何原理中表面积大而体积相对小的形状；其培养步骤包括 Al.调制培养液和产毒培养基，A2.根据生产量的大小和培养时间来选择、组装相应的透析培养器，将培 养基和培养液分别加注到透析培养器的培养基室和培养室内，高温灭菌后冷却到35°C~4(TC,培养基与培养液的比例是由细菌及微生物的品种和生长周期决 定；高温灭菌可以在113。C条件下灭菌30分钟； 'A3.将经过适当培养的培养菌菌种，接种到培养室内，接种量为按培养室 中培养液量的3°/ ~5%，按培养菌的培养时间和培养温度进行产毒培养；透析培养的产量与透析面积成正比。B、 除菌过滤经镜;险为纯培养后，用收液管收取从透析器培养室中培养好的培养菌菌液， 然后在《0。C的环境下离心处理，取上清液，用OO. 22mm除菌滤寿反或者无石棉除 菌膜过滤，即得外毒素毒液；离心处理最好在低温高速离心机上以6000转/分 钟的速度离心IO分钟。C、 沉淀浓缩将毒液与-70。C的无水乙醇按1: 2的比例混合，将混合液倒入离心罐，放 入-20。C的环境(如冰拒)中静置8~12小时，然后在《(TC的环境下以12000 转/分钟的速度离心25~30分钟，去上清液，所剩固体即是变性的细菌外毒素。D、 透析结晶将离心后所得固体物用适量的硫酸铵溶液溶解并充分混合，然后倒入透析袋内，将透析袋周围贴紧大分子吸附剂，在< 5°C环境中用大分子吸附剂将透析 袋内的硫酸铵溶液吸出，透析袋内所剩固体物即为结晶毒素。可以重复此步骤， 直到OD260/OD280值小于0. 6为止。E、保藏，将纯度达到OD260/OD280值小于0. 6、毒力合格的结晶物放入《 15X:的保护剂中稀释，并按蛋白质的冻干曲线冻干，然后冷藏。本专利技术的细菌的培养方法的进一步具体方案为培养基室的容积与培养室 的总容积之间的关系是培养时间越长培养基室的容积与培养室的总容积之比越 大，反之亦反，培养时间大于120小时时，培养基室的容积与培养室的总容积 之比为3: 1;培养时间为96~120小时时，培养基室的容积与培养室的总容积 之比为2. 5: 1,培养时间为72~96小时时，培养基室的容积与培养室的总容积 之比为2: 1,培养时间为48-72小时，培养基室的容积与培养室的总容积之比 为1.5: 1,培养时间为24~48小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比 为1: 1-2,培养时间小于24小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比 为1: 3~ 6。本专利技术的培养液的进一步限定为培养液为0. 6°/ NaCl溶液。本专利技术的培养基的进一步限定为所述产毒培养基根据菌种的具体情况选 择，并按照1000ml培养基加入200 ±50g酵母浸膏的比例加入酵母浸膏。培养 基尽可能选择消化型的。本专利技术的保藏工序中所用的保护剂的成分为保护剂由明胶、蔗糖、甘露 醇、蒸馏水配制而成。本专利技术的保藏工序中所用的保护剂的比例为保护剂中明胶、蔗糖、甘露 醇、蒸馏水的配比为3/5/5/100。本专利技术的保藏工序中所用的保护剂的保护剂配制方法为按配置量分别称 取明胶、蔗糖、甘露醇，先将明胶加入蒸馏水，加热到明胶全部溶化为止，再 加入蔗糖和甘露醇，充分溶解后，滤球过滤，在113。C条件下经30分钟灭菌。由于采用了上述技术方案，本专利技术取得了如下的技术进步采用本专利技术的方法生产毒素，优化细菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌外毒素的生产方法，包括细菌及产毒培养、细菌外毒素的提取、纯化、保藏工序，其特征在于：包括如下步骤　Ａ、产毒培养　细菌的产毒培养是在微生物透析培养器中进行，微生物透析培养器包括培养基室和培养室，培养基室和培养室之间设置有透 析膜及支撑保护透析膜的装置，培养基室为一个，培养室装配培养基室上，培养室的数量是培养基室的倍数，培养基室的容积与培养室的总容积之比根据微生物的培养时间的长短在３∶１到１∶６之间选定，微生物的生长所需要的设施设置在培养基室中；其培养步骤包括　　Ａ１．调制培养液和产毒培养基，　Ａ２．根据生产量的大小和培养时间选择、组装相应的透析培养器，将培养基和培养液分别加注到透析培养基室和培养室内，高温灭菌后冷却到３５℃～４０℃，　Ａ３．将经过适当培养的培养菌菌种，接种到培养室 内，接种量为按培养室中培养液量的３％～５％，按培养菌的培养时间和培养温度进行产毒培养；　Ｂ、除菌过滤　收取培养好的培养菌菌液，然后在≤０℃的环境下离心处理，取上清液，过滤，即得外毒素毒液；　Ｃ、浓缩沉淀　将毒液与－７ ０℃的无水乙醇按１∶２的比例混合，将混合液放入－２０℃环境中静置８～１２小时，然后在≤０℃的环境下以１２０００转／分钟的速度离心２５～３０分钟，去上清液，所剩固体即是变性的细菌外毒素；　Ｄ、透析结晶　将离心后所得固体物用适量的硫 酸铵溶液溶解并充分混合，然后倒入透析袋内，在≤５℃环境中用大分子吸附剂将透析袋内的硫酸铵溶液吸出，透析袋内所剩固体物即为结晶毒素；　Ｅ、保藏　将纯度达到ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值小于０．６、毒力合格的结晶物放入≤１５℃的保护剂中稀 释，并按蛋白质的冻干曲线冻干，然后冷藏。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林涛，朱明温，林雅静，张鹏成，
申请(专利权)人：林涛，
类型：发明
国别省市：63[中国|青海]