人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab及应用。所述抗体的VL链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：SEQIDNO.1所示的L-CDR1；SEQIDNO.2所示的L-CDR2；SEQIDNO.3所示的L-CDR3；并且所述抗体的VH链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：SEQIDNO.8所示的H-CDR1；SEQIDNO.9所示的H-CDR2；SEQIDNO.10所示的H-CDR3。该抗体能够特异性结合炭疽保护性抗原（PA），阻断致死因子合LF进入细胞内，从而发挥保护性作用。
【技术实现步骤摘要】
人源抗炭疸毒素保护性抗原中和抗体Fab及应用
本专利技术属于基因工程抗体
，尤其涉及利用噬菌体抗体库技术，筛选人源抗炭疽毒素保护性中和抗体Fab，用于制备炭疽病预防与治疗的药物。技术背景炭疽病(anthrax)是一种由炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)引起的急性传染病，主要通过皮肤、呼吸道和消化道感染动物和人。炭疽芽孢杆菌在血液中可产生并释放两种炭疽毒素:致死毒素(lethal toxin, LeTx)和水肿毒素(edema factor, EF )。炭疽致死毒素由:保护性抗原(protective antigen, PA )和致死因子(lethal factor, LF)组成。保护性抗原(PA)与人体细胞膜蛋白结合，并Furin蛋白酶裂解成两个片段PA63和PA20。PA63分子连接形成七聚体，与EF或LF结合并进入细胞导致细胞死亡。在体外实验研究中，单独使用高纯度的致死毒素或水肿毒素可以使动物死亡或发生水肿。通过阻断保护性抗原与LF的结合或者PA与细胞膜受体的结合，可有效防止炭疽毒素的致病作用。因此，保护性抗原(PA)便成为炭疽病的理想治疗靶点。本专利技术以保护性抗原PA63为靶分子，通过人源噬菌体抗体库的筛选，制备人源抗炭疽保护性抗原的中和抗体Fab (命名为PAFab)，并对筛选获得的PAFab克隆进行表达、纯化以及功能鉴定。免疫学检测结果显示，该抗体能够与炭疽保护性抗原特异性结合，体外中和试验结果证实，该抗体能够有效阻断炭疽毒素的致病作用
技术实现思路
解决的技术问题:本专利技术目的是提供一种人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab及应用。技术方案:人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab，所述抗体的 '链的互补决定区具有以下的CDRs氣基酸序列:SEQ ID N0.1 所示的 L-CDRl ；SEQ ID N0.2 所示的 L-CDR2 ；SEQ ID N0.3 所示的 L-CDR3 ； 并且所述抗体的Vh链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列:SEQ ID N0.8 所示的 H-CDRl ；SEQ ID N0.9 所示的 H-CDR2 ；SEQ ID N0.10 所示的 H-CDR3。 所述抗体的八链的可变区氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示，Vh链的可变区氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。所述表达抗体\链的可变区核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，表达Vh链的可变区核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。所述人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在制备炭疽病治疗抗体相关药物中的应用。所述核苷酸表达的人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在制备炭疽病治疗抗体相关药物中的应用。人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在治疗炭疽病中的应用。本专利技术的目的是通过下列措施实现的:利用抗原固相筛选的方法筛选人源噬菌体抗体库(Fab抗体库)。经五轮筛选后,用酶联免疫吸附反应(enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)进行阳性克 隆鉴定，筛选出人源抗炭疽保护性抗原(PA)的特异性抗体PAFab。经原核表达PAFab抗体，并用Protein L亲和层析柱纯化，纯化产物经ELISA进行分析和体外中和活性鉴定。有益效果:该抗体能够特异性结合炭疽保护性抗原(PA)，阻断致死因子合LF进入细胞内，从而发挥保护性作用。附图说明图1炭疽保护性抗原PA63融合基因在大肠杆菌系统中的表达，1、3::细菌超声上清,2、4:细菌的超声沉淀，M:蛋白marker ； 图2纯化的保护性抗原PA63 SDS-PAGE分析，1、3:非特异性洗脱，2:纯化的目的蛋白，M:蛋白 marker ； 图3噬菌体抗体库筛选的ELISA检测； 图4诱导抗炭疽保护性抗原Fab表达的Western blot分析，M:Marker ；1:阳性工程菌的超声上清；2:阳性工程菌的超声沉淀； 图5纯化的抗炭疽保护性抗原Fab (PAFab) SDS-PAGE分析，M:Marker ; 1:纯化的Fab ； 图6纯化的抗炭疽保护性抗原Fab (PAFab)的Western blot分析，M:Marker ;1:纯化的Fab ； 图7纯化后抗PA63人源抗体Fab片段的ELISA检测； 图8抗PA基因工程抗体Fab的中和活性分析。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明 实施例1 炭疽保护性抗原(PA63)抗原蛋白的表达与纯化 根据genebank中AF306782的基因序列，合成保护性抗原(PA63)抗原基因，用限制性内切酶及聖7 I和I双酶切并克隆于原核表达载体pColdll中，氯化钙法转入大肠杆菌BL21 (DE3)中并涂布于LB琼脂平板(100 μ g/mL氨苄青霉素抗性)上37°C孵育12小时。将含有重组质粒的BL21菌株接种到含氨苄青霉素(100 μ g/ L)的LB中，37 °〇震荡过夜；次日转接，37 °C培养至菌液吸光度(A)值600约0.6时，加异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达蛋白，至终浓度为 I mmol/ L, 25V 190 r/min震荡；诱导12小时。用12% SDS-PAGE分析保护性抗原PA63抗原蛋白表达，结果如图1所示，在55-72KD间出现明显的蛋白条带。保护性抗原(PA63)抗原蛋白的纯化。离心收集表达保护性抗原PA63菌液。用PBS 45 mL重悬细菌，超声碎菌。4°C收集上清过滤；将含有保护性抗原PA63的上清，经亲和层析柱纯化，收集蛋白；SDS-PAGE分析蛋白表达含量，纯度达90%以上(图2)，样品于-70V贮存备用。 人源抗PA特异性抗体Fab的筛选 噬菌体抗体库的富集筛选:用纯化的保护性抗原(PA63)抗原蛋白包被固相筛选ELISA板，每孔I μ g,洗涤，加封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体；加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，感染增殖，加入辅助噬菌体VCSM13超感染；重复以上筛选步骤，共进行五轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选； ELISA鉴定阳性克隆:将最后一轮筛选得到的噬菌体稀释后铺于培养板上培养过夜，挑取64个单菌落于细胞培养板中,振摇培养过夜；从第一块板各孔中分别转移5 μ L菌液至第二块板，振摇培养；加辅助曬菌体VCSM13超感染,振摇培养；离心,培养基重悬沉淀,振摇培养过夜。离心取上清进行ELISA检测，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm-A650nm计算每孔吸光值；iP/N值(Positive/Negative)大于2.1时,该菌株为阳性单克隆曬菌体菌株(图3)。阳性克隆经核酸序列分析后，发现有I株Fab克隆与PA63重组蛋白有较强的结合活性。Fab重、轻链可变区基因序列分析应用以下两个服务器:http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest livret=0&0ption=mouseIghttp://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgiFab的核酸序列及氨基酸序列如下: 重链可变区核苷酸序本文档来自技高网...
【技术保护点】
人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab，其特征在于，所述抗体的VL链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：SEQ?ID?NO.1所示的L?CDR1；SEQ?ID?NO.2所示的L?CDR2；SEQ?ID?NO.3所示的L?CDR3；并且所述抗体的VH链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：SEQ?ID?NO.8所示的H?CDR1；SEQ?ID?NO.9所示的H?CDR2；SEQ?ID?NO.10所示的H?CDR3。
【技术特征摘要】
1.人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab，其特征在于，所述抗体的\链的互补决定区具有以下的CDRs氣基酸序列:SEQ ID N0.1 所示的 L-CDRl ；SEQ ID N0.2 所示的 L-CDR2 ；SEQ ID N0.3 所示的 L-CDR3 ； 并且所述抗体的Vh链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列:SEQ ID N0.8 所示的 H-CDRl ；SEQ ID N0.9 所示的 H-CDR2 ；SEQ ID N0.10 所示的 H-CDR3。2.根据权利要求1所述的人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab，其特征在于，所述抗体的'链的可变区氨基酸序列如...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱进，冯振卿，汪楠，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区军事医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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