一种PCV2病毒样颗粒及其制备方法和裂解及VLP组装缓冲液技术

本发明专利技术公开了一种PCV2病毒样颗粒及其制备方法和裂解及VLP组装缓冲液。基于自主优化设计，并人工合成适合在原核表达系统中高效表达的PCV2核衣壳蛋白基因，通过大肠杆菌原核表达系统表达PCV2核衣壳蛋白的全长基因序列，并利用其可溶性核衣壳蛋白在特定条件下高效自体组装成了病毒样颗粒。本发明专利技术创新点主要在于采用不同于常规的真核表达系统获取VLPs方法，而是利用原核表达系统获取PCV2VLPs，本方法成本低廉、简单高效，适合大规模产业化应用；其中还应用到独创的既可以促进菌体裂解又能适合VLPs自体组装的双功能于一体的缓冲液配方；另外发明专利技术所获得的PCV2病毒样颗粒与野生型病毒外形相似度高，并且免疫原性好，可以用于研发具有应用潜力的猪圆环病毒的亚单位疫苗及药物传递载体。

【技术实现步骤摘要】
—种PCV2病毒样颗粒及其制备方法和裂解及VLP组装缓冲液
本专利技术属于猪圆环病毒疫苗研究
，具体涉及一种PCV2病毒样颗粒的制备方法、及该方法制备得到的病毒样颗粒，还有方法中用到的裂解及VLP组装缓冲液。
技术介绍
猪圆环病毒二型(porcine circovirus type2, PCV2)属于圆环病毒科，直径约为17nm，无囊膜，二十面体对称，共价闭合环状单股DNA病毒。PVC2是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原，还会导致育肥猪皮炎与肾病综合征(porcine dermatis and nephropathy syndrome, F1DNS)、猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、新生仔猪的腹?写病等综合征以及猪体内免疫抑制，很难进行有效的药物治疗，此外，PVC2常与诸多病原并发或继发感染，无疑为PVC2感染的准确诊断及有效防控增加了难度。PVC2该病毒目前已经在世界主要养猪生产大国的猪群中广泛传播，并已造成巨大的经济损失，建立高效预防方法对病毒的综合防控具有重要意义。 猪圆环病毒疫苗的研制成功于2006年并开始在北美应用，给全球养猪业带来了福音；2009年勃林格猪圆环病毒疫苗在中国首家注册成功和2010年第一个上市，2010年下半年国产疫苗的陆续上市。目前的亚单位疫苗就是将PCV2基因组中编码免疫原性蛋白的0RF2片段插入到昆虫杆状病毒中，通过培养昆虫杆状病毒而快速、大量获得具备免疫原性的PCV2核衣壳蛋白，再将其制备成疫苗。如勃林格殷格翰动物保健(美国)有限公司的FLEX系列茵格发猪圆环病毒疫苗和英特威/先灵葆雅动物保健公司的PCV2疫苗。还有一种是嵌合病毒灭活苗，原理是用PCV2的0RF2片段置换为不致病的PCVl中的0RF2片段，即获得了 PCV1-PCV2嵌合病毒，具有与PCV2类似的免疫原性。辉瑞/富道动物保健公司研制的PCV2疫苗即是采用了这种技术。全病毒PCV2灭活疫苗，由于PCV2难培养、生长慢及难灭活，培养成本高，生产周期长，所以多数动物保健公司采用成熟的分子生物技术生产亚单位疫苗。目前在国外只有梅里亚动物保健公司生产全病毒灭活疫苗，适用于母猪免疫。已经注册的国产圆环病毒疫苗均为全病毒灭活疫苗。2010年分别由哈尔滨兽医研究所用LG株、南京农业大学用SH株研制而成的“圆克清”。由哈尔滨维科生物技术开发公司、上海海利生物药品有限公司生产出猪圆环病毒2型LG株全病毒灭活疫苗“圆毕净”；由洛阳普莱柯生物工程有限公司、江苏南农高科技股份有限公司生产出猪圆环病毒2型SH株全病毒灭活疫苗，2011北京大北农集团研发出“诸欢泰”。以上全病毒培养物在灭活前的病毒含量约105 5-6_°TCID5(l/mL。应用的灭活剂为甲醛溶液(福尔马林)。在国际上应用PK-15传代细胞培养PCV2的最高含量很难超过103_5TCID5(l/mL，而国内应用微载体细胞悬浮培养技术，使抗原效价提高了 100多倍。抗原蛋白纯化是减少疫苗过敏反应的重要一环，国产疫苗亟待提高纯化工艺，以达到无超量杂质蛋白。 中国猪圆环病毒疫苗市场情况汇总 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PCV2病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：1）选取利用密码子的兼并性，人工合成的适合于原核表达的编码PCV2核衣壳蛋白全长基因；2）将基因序列与表达质粒载体重组得到的重组质粒转化大肠杆菌，然后加入IPTG，使得体系中其浓度为0.1‑1mM，并在25‑37℃进行诱导表达；3）将诱导表达PCV2核衣壳蛋白时获取的细菌沉淀用以下配方的裂解及VLP组装缓冲液重悬，超声处理，离心收集上清，树脂吸附目的蛋白，然后从树脂上洗脱目的蛋白；所述的裂解及VLP组装缓冲液配方为：0.1M NaH2PO4·2H2O、0.1M Na2HPO4、20mM Imidazole、10mM Tris‑base、300mM NaCl、50mM KCl、2mM MgCl2、0.1M Ammonium citrate、2%Glycerine、0.5%Triton X‑100、5mMβ‑Me、0.1mM PMSF、1U/mL Leupeptin Protease inhibitor；其中Triton X‑100、β‑Me、PMSF、Leupeptin Protease inhibitor现用现加，缓冲液pH8.0，余量为纯水。...

【技术特征摘要】
1.一种PCV2病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤: 1)选取利用密码子的兼并性，人工合成的适合于原核表达的编码PCV2核衣壳蛋白全长基因； 2)将基因序列与表达质粒载体重组得到的重组质粒转化大肠杆菌，然后加入IPTG，使得体系中其浓度为0.1-lmM，并在25-37°C进行诱导表达； 3)将诱导表达PCV2核衣壳蛋白时获取的细菌沉淀用以下配方的裂解及VLP组装缓冲液重悬，超声处理，离心收集上清，树脂吸附目的蛋白，然后从树脂上洗脱目的蛋白；所述的裂解及 VLP 组装缓冲液配方为:0.1M NaH2PO4.2H20、0.1M Na2HPO4,20mM Imidazole、1mM Tris-base>300mM NaCl、50mM KCl> 2mM MgCl2、0.1M Ammonium citrate>2%Glycerine>0.5%Triton X_100、5mMβ-Me、0.1mM PMSF、lU/mL Leupeptin Protease inhibitor ;其中Triton X-100、β-Me、PMSF、Leupeptin Protease inhibitor 现用现加，缓冲液 pH8.0,余量为纯水。2.根据权利要求1所述的PCV2病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述的利用密码子的兼并性，人工合成的适合于原核表达的编码PCV2核衣壳蛋白全长基因见SEQ N0.1所示。3.根据权利要求1所述的PCV2病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的表达质粒载体为pET100_D/T0P0。4.根据权利要求1所述的PCV2病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤2)中IPTG在体系中的浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨毅，雷昕诺，王乃东，邓治邦，湛阳，王爱兵，薛立群，张颜，
申请(专利权)人：美国普赛生物高科技有限责任公司，湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：美国;US