联合检测HBV前S1抗原和核心抗原的方法及诊断试剂盒技术

本发明专利技术公开了通过对乙型肝炎病毒相关的前Ｓ１抗原（ＨＢＶ　　ＰｒｅＳ１）与核心抗原（ＨＢｃＡｇ）联合检测，诊断乙肝病毒感染的方法。本发明专利技术还公开了采用双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒前Ｓ１抗原的方法。本发明专利技术还公开了用于上述检测的试剂盒和病毒裂解液以及它们的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及乙型肝炎病毒检测领域，更具体地涉及通过对乙型肝炎病毒相关的前S1抗原(HBV PreS1)与核心抗原(HBcAg)联合检测，诊断乙肝病毒感染的方法。本专利技术同时公开了乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原联合检测试剂盒(特别是酶联免疫法与化学发光法)。本专利技术还涉及前S1抗原的检测方法、病毒裂解方法以及相关的试剂盒。
技术介绍
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)感染是全世界最重要的公共卫生问题之一。目前，HBV血清标志物(常规如HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb即俗称“两对半”检测)广泛作为现症HBV感染和既往HBV感染的常规检测标准。但是，高的变异率再加上HBV携带者的庞大基数导致常规的“两对半”检测的假阴性高发。并且，普通“两对半”检测无法从量上反映病毒复制性和传染性大小，常出现可怀疑难解释的结果，也无法从“两对半”指标直接确定检测个体并未感染HBV。HBV DNA是HBV复制的直接指标，其斑点杂交检测(或PCR检测)是乙型肝炎患者和HBV携带者感染与传染性判断的金标准。PCR检测与斑点杂交检测均可作为HBV感染和传染性的直接指标，但是不适合大规模普查或常规使用。在所有可能与HBV DNA高度相关的血清标志抗原(HBV PreS1、HBcAg、HBxAg、DNAP、HBV PreS2等)中HBcAg一直被认为是与HBVDNA直接相关的抗原，检测在HBcAg在复制型病毒定量和HBsAg阴性的HBV感染者与HB患者中特有诊断意义。但是鉴于检测HBcAg的种种困难，当前的已开发或已报道的HBcAg免疫学诊断试剂通常采取检测前对样品进行前处理(裂解病毒、破膜并灭活HBcAb)或采用迂回检测HBcAg-HBcAb免疫复合物的方式进行，前者操作复杂程序繁琐，不易被临床客户接受，亦不适合用于大规模献血员筛查及流行病学调查。后者则因为检测方式的特殊性，难以达到理想的特异性和灵敏度。而HBV PreS1与HBV DNA也有很好的相关性(D.Buffello，2000，96％；Kuijpers，1989，88％；Theilman，1986)。对与HBV PreS1抗原的诊断方法，当前的已开发或已报道的PreS1免疫学诊断试剂考虑到PreS1相对HBsAg绝对浓度低的多，常规双PreS1抗体夹心法较难达到理想的灵敏度，常采用检测整个LHBs(即通过LHBs上的HBsAg介导检测，用针对HBsAg的特异性抗体作为捕获抗体或报告抗体，再用针对PreS1的特异性抗体与之配对)，这种检测模式有效地放大了PreS1的检测灵敏度，但是将PreS1的检测完全依赖于HBsAg，不形成一个独立的检测系统，可能出现因为HBsAg突变而造成PreS1假阴性出现，不能准确反应突变病毒或不同亚型病毒感染的PreS1动态。开发一种简单、准确而又高灵敏度的HBV现症感染的直接ELISA诊断试剂在HBV感染流行病控制，HB患者抗病毒疗效及病程预后方面都具有迫切的现实意义。因此，本领域仍然缺乏有效检测乙肝病毒的方法。专利技术概述本专利技术一个目的是希望建立简单、有效、无须样品前处理过程的HBcAg检测方法和高灵敏度的双Pres1抗体夹心法检测PreS1的方法，并通过联合检测HBcAg与PreS1模式弥补可能因单一HBcAg或PreS1突变或漏检造成假阴性的缺点，构建一种与HBV DNA高度相关的联合(HBcAg和PreS1)检测模式，并将这种模式应用于酶联免疫法，化学发光，时间分辨，胶体金法、酶联免疫渗滤法等定性或定量的免疫学诊断。本专利技术涉及一种通过联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原建立的与核酸检测方法高度相关的免疫学诊断方法。本专利技术涉及了联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原的试剂盒及其制备方法。具体地，本专利技术涉及了联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原的酶联免疫试剂盒和化学发光试剂盒及其制备方法。本专利技术的联合检测模式不仅有效的体现了联合检测两种抗原的互补优势，且联合检测结果形成的新指标——“核酸相关抗原”体现出与乙型肝炎病毒核酸指标高度的相关性。此外，本专利技术首次公布了一种高灵敏度双前S1抗体夹心检测前S1抗原的方法，该方法不同于已公布的其他检测前S1抗原的方法。在上述方法一个特别优选的实施方案中，本专利技术首次使用了一系列含不同剂量不同种类的表面活性剂的缓冲溶液用于裂解病毒，大大提高前S1抗原与核心抗原联合指标和前S1抗原单独指标的检测灵敏度。 附图说明图1显示了preS1区21-47AA片段三重串联的重组质粒pT-2147*3的构建过程。图2显示表达和纯化的重组蛋白GST-2147*6的SDS-PAGE电泳结果。结果显示纯化后目的蛋白的纯度超过85％。泳道1蛋白marker；泳道2表达的pGEx-2147*6；泳道3纯化后的pGEX-2147*6。图3显示化学发光检测与荧光定量PCR相关性。如实施例14所述，对各标本的病毒含量及发光强度分别取对数后进行线性相关性分析。专利技术详述除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本专利技术涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。本专利技术涉及一种通过联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原建立的与核酸检测方法高度相关的免疫学诊断方法。在本专利技术的一个具体实施方案中，通过单独检测前S1、核心抗原与联合检测前S1抗原/核心抗原(酶联免疫法)的比较，联合检测前S1抗原/核心抗原比单独检测前S1与核心抗原具有明显的优势。本专利技术的又一实施方案中，将联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原(酶联免疫法)与常规乙型肝炎两对半检测进行比较，本检测方法对部分含有病毒的标本可以准确定性，而两对半检测对此类标本未能准确定性。本专利技术的又一实施方案中，将此联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原的检测方法应用于化学发光诊断中，联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原的检测定量结果与病毒含量有较好的线性相关性。本专利技术的又一实施方案中，本专利技术检测方法采用酶联免疫方法来实现。相应地，本专利技术提供了相关的酶联免疫试剂盒的制备方法和由此制备得到的试剂盒。本专利技术的又一实施方案中，本专利技术检测方法采用化学发光方法来实现。相应地，本专利技术提供了相关的化学发光试剂盒的制备方法和由此制备得到的试剂盒。下面对上述方面和其它方面进行更加详细的说明。联合检测乙肝病毒的前S1抗原和核心抗原(简称联合检测)在一方面，本专利技术涉及一种在样品中检测乙型肝炎病毒或者检测乙型肝炎病毒感染的方法，包括联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原。在此，为了本专利技术的目的，“联合检测”包括对前S1抗原的检测和对核心抗原的检测分开进行或者合并进行，以及同时进行和以任何顺序先后进行，只要对前S1抗原的检测和对核心抗原的检测两者的信号处理联合进行即可。联合进行信号处理是指，在判断样品为乙型肝炎病毒或者乙型肝炎病毒感染阳性还是阴性时，将前S1抗原检测得到的信号和核心抗原检测得到的信号合并成为单一的一个指标来判断。例如，可将两个抗原检测得到的信号简单相加，与预定的值相比较来判断。或者，可以将两个抗原检测得到的信号通过适当处理或者运算(例如对其中一个信本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测乙型肝炎病毒或者检测乙型肝炎病毒感染的方法，包括在样品中联合检测（包括分开检测和合并检测，以及同时检测和以任何顺序先后检测，优选同时、合并检测）乙型肝炎病毒前Ｓ１抗原与核心抗原。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：葛胜祥，袁权，赵昱，罗文新，张军，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门大学，北京万泰生物药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]