源自生药的成分的高灵敏度定量方法技术

源自生药的成分的高灵敏度定量方法包括：提取工序，通过将碱或醇中混合有生物样品的混合物注入具有反相分配功能及阴离子交换功能的固相中后，用清洗液至少对所述固相清洗一次，之后利用酸性醇从所述固相中洗脱，从而制备含有源自生药的成分的提取物；以及定量工序，通过质谱法对经由所述提取工序提取的提取物中的选自由甘草甜素、甘草次酸、甘草甜素及甘草次酸的代谢物、甘草甜素及甘草次酸的类似物、甘草中含有的皂苷成分以及它们药学上可接受的盐组成的组中的至少一种进行检测，并定量。

High sensitivity and quantitative methods from crude drug ingredients

Including high sensitivity and quantitative methods from crude drug ingredients: extraction process, the alkali or alcohol are mixed into the mixture of biological samples with solid phase distribution function and anion exchange function after cleaning liquid for cleaning of the solid phase at least once, after the use of acid alcohol from the solid phase elution. To prepare the extract prepared from the crude drug containing components; and the quantitative detection process, at least one of the freedom of choice through the extraction of licorice extract extraction step in sweet, glycyrrhetinic acid and glycyrrhizin containing hormone and metabolite glycyrrhetinic acid, glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid analogues and in licorice saponins and their pharmaceutically acceptable salts by mass spectrometry in the group, and quantitative.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于对生物样品中的甘草甜素及其代谢物等高灵敏度地进行定量的方法。本申请基于并要求于2010年11月16日提交的日本专利申请2010-256187号的优先权，并将其全部内容结合于此，作为参考。
技术介绍
甘草甜素(以下简称GL)及其盐是具有抗过敏作用、抗炎症作用、以及免疫调剂作用、肝细胞损害抑制作用、肝细胞繁殖促进作用、病毒繁殖抑制作用/灭活作用等多种多样生理活性的甘草根提取成分。在日本，自古以来被用作中药等的临床药物，现在被广泛用于治疗慢性肝脏疾病、湿疹/皮炎、婴儿苔癣、圆形脱毛症(円形脱毛症)、各种过敏、炎症等。并且，作为除医药品之外的用途，由于GL具有耐盐(塩々&)效果并具有甜味效果，因此作为甜味剂多用于腌菜和调料等众多食品。根据非临床试验的结果认为，GL具有容易积聚在肝脏且迅速被排泄至胆汁中的特性，并一边进行代谢以及肠肝循环一边被排出。特别是口服给药中，作为配糖体(配糖体)的水溶性极性物质的GL显示低吸收性，同时由于被肠道细菌代谢和首过效应，在末梢血液中的浓度极低。因此，为了测定GL的血液 中的动态，迄今为止已经尝试过各种各样的方法，但是难以检测服用含GL的制剂、掺合甘草的中药制剂时血液中的GL，长期以来也不清楚其动态。例如，存在以下测定方法:对采自口服GL后的健康者的血浆，进行甲醇处理除去蛋白质后，通过酶免疫法(EIA)测定该血浆中的GL的量的方法；以及利用采用了十八烷基化学结合型(ODS)柱等具有反相分配功能的柱的高速液相色谱法(HPLC)的测定方法(例如非专利文献I 4)。但是，这些测定方法中，定量临界值最多为0.1 u g/mL左右，即使能够检测出作为主代谢物的甘草次酸(以下简称为GA)，也无法检测出GL。因此，根据从尿中检测的示例，间接证明了 GL的血液中转移(参照非专利文献4)。于是，对含GL的制剂的药效，以可定量的GA代替GL作为评价指标。在先技术文献非专利文献非专利文献1:石渡(^ 7夕)，其他7名，《生化及药剂学期刊》(才口 'I力)v 了 'y Y 7 7 一'y 3-一 r -1 力卟 7'' r > (Biological and PharmaceuticalBulletin))，2000 年第 23 卷第 8 号第 904 905 页。非专利文献2 -M 格鲁特(De Groot)，其他I名，《色谱法杂志》(夕\ 一 f > 才 /' 夕口卜夕9 7 ^ — (Journal of Chromatography)), 1988 年第 456 卷第 71 81 页。非专利文献3:中田(f力夕)，其他3名，《和汉药学会志》(和漢医薬学会誌)，1986年第3卷第3号第278 279页。非专利文献4:山村(W A 9 )，其他7名，《美国药学杂志》(一 f > 才7'' 7 T 一 ■ '> 工一 r -1 力卟 寸 4 工 > 文' (Journal of Pharmaceutical Sciences)),1992年第81卷第10号第1042 1046页。
技术实现思路
专利技术要解决的技术问题作为活性主体的原形药物GL的药代动力学，在根据有效性、安全性判断为恰当使用后，是有用的。为此，希望不以GA为评价对象，而能够对血浆等生物样品中的GL量进行定量。鉴于上述技术问题，本专利技术的目的在于提供用于检测血浆等生物样品中的GL并进行定量的方法。解决技术问题的技术方案为解决上述技术问题，本申请各专利技术人进行了深入研究，结果发现，首先，利用采用了具有反相分配功能以及阴离子交换功能的固相的固相提取法从生物样品中提取出含有GL的成分后，通过质谱法分析提取物中的GL，能够检测并定量生物样品中的GL，至此完成本专利技术。·S卩，本专利技术提供以下内容:(I) 一种，其特征在于，具有:提取工序，通过将碱或醇中混合有生物样品的混合物注入具有反相分配功能及阴离子交换功能的固相中后，用清洗液对上述固相清洗至少一次，之后利用酸性醇从上述固相中洗脱，从而制备含有源自生药的成分的提取物；以及定量工序，通过质谱法对经由上述提取工序提取的提取物中的选自由甘草甜素、甘草次酸、甘草甜素及甘草次酸的代谢物、甘草甜素及甘草次酸的类似物、甘草中含有的皂苷成分以及它们药学上可接受的盐组成的组中的至少一种进行检测，并定量，其中，上述清洗液是选自由水、碱、醇及乙腈组成的组中的一种或两种以上的混合液。(2)上述(I)所记载的，其特征在于，在上述提取工序中，通过用碱和醇和水的混合液清洗后，再用醇、醇和水的混合液、或者乙腈进行清洗，以进行固相的清洗。(3)上述(2)所记载的，其特征在于，上述碱和醇和水的混合液是将按体积计0.5% 28%的氨水和甲醇以99:1 1: 3混合后形成的混合液。(4)上述(I) (3)中任一项所记载的，其特征在于，上述生物样品是血液、血浆或者组织提取物。专利技术效果根据本专利技术的，能够检测含量非常少的生物样品中的GL，并进行定量。因此，通过利用本专利技术的，能够对从摄取含有GL的制剂或饮食的人身上采取的生物样品中的GL进行定量，并能够高精度地解析药代动力学。附图说明图1A是表示实施例6中空白血浆样品中的GL的色谱图。图1B是表示实施例6中空白血浆样品中的GA的色谱图。图1C是表示实施例6中空白血浆样品中的内部标准(IS)的色谱图。图2A是表示实施例6中，添加有标准溶液(G)的血浆样品(血浆中的GL添加量:0.5ng/mL)中的GL的色谱图。图2B是表示实施例6中，添加有标准溶液(G)的血浆样品(血浆中的GA添加量:2ng/mL)中的GA的色谱图。图2C是表示实施例6中，添加有标准溶液(G)的血浆样品中的IS的色谱图。图3是表示实施例7中GL的平均血药浓度变化的图。 图4是表示实施例7中GA的平均血药浓度变化的图。 具体实施例方式本专利技术的的特征在于，通过采用了具有反相分配功能以及阴离子交换功能的固相的固相提取法提取出生物样品中的GL之后，通过质谱法对得到的提取物中的GL含量进行定量。通过利用质谱法代替现有的HPLC法等进行定量，能够提高GL的检测灵敏度。并且，不利用采用现有的ODS柱这种仅具有反相分配功能的固相的固相提取法，而是利用具有反相分配功能以及阴离子交换功能的固相进行制备，由此能够从供质谱分析的提取物中除去更多的异物，从而能够大幅地提高质谱分析的灵敏度。具体而言，本专利技术的的特征在于，包括:提取工序，通过将碱或醇中混合有生物样品的混合物注入具有反相分配功能以及阴离子交换功能的固相后，用清洗液清洗上述固相一次或两次以上，之后利用酸性醇从上述固相中洗脱，从而制备含有源自生药的成分的提取物；以及定量工序，通过质谱法对经由上述提取工序提取的提取物中的GL、GA、GL及GA的代谢物、GL及GA的类似物、甘草中含有的皂苷成分以及选自由上述物质的药学上可接受的盐构成的组中的至少一种进行检测，并定量，上述清洗液是选自由水、碱、醇以及乙腈构成的组中的一种或两种以上的混合液。优选上述提取工序中制备含有至少两种源自生药的成分的提取物，优选上述定量工序中在一次测定(检测模式除外)中对至少两种成分进行检测、定量。根据本专利技术的定量的源自生药的成分是选自由GL、GA、GL及本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：铃木加代子，铃木恒阳，冢原路子，春田裕子，八田明，浜田雄二，井上秀雄，
申请(专利权)人：米诺发源制药株式会社，
类型：
国别省市：