用于调整肌腱愈合的材料和方法技术

本发明专利技术涉及微小RNA 29及其前体和模拟物用于调整肌腱损伤和肌腱的生物力学特性的用途。具体而言，本发明专利技术来源于以下发现：肌腱细胞中的1型胶原的合成对miR‑29的敏感度低于3型胶原的合成，因而使得能够将胶原亚型之间的平衡调整成有利于1型胶原，从而缓解愈合期间生物力学特性的降低。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及微小RNA 29及其前体和模拟物用于治疗肌腱损伤和调整肌腱的生物力学特性的用途。专利技术背景许多常见的包括肌腱病症的肌骨骼病变的特征是调节异常的组织修复和炎症1。肌腱病代表了肌骨骼初级护理会诊的常见疾病(precipitant)2-3并且占所有运动损伤的30％-50％3。肌腱病的特征在于胶原产生从亚型1变为亚型3，从而导致抗张强度降低，这能够预示临床肌腱断裂4。炎症介质被认为对于肌腱病的发作和持续存在来说是至关紧要的5。炎症细胞谱系和肌腱细胞中已经展现了各种细胞因子的表达，从而表明浸润群体和居留群体两者都参与病变6-9。IL-6缺陷的小鼠体内愈合的肌腱的机械特性要较正常对照相逊色10，而TNF-α阻断提高了大鼠肌腱损伤模型中肌腱-骨愈合的强度11。虽然这些数据产生了细胞因子靶向可以提供治疗效用的令人感兴趣的可能性，但是当前对肌腱疾病的细胞因子/基质生物学的机制理解还不足以在实践中体现这种可能性。白细胞介素33是IL-1细胞因子家族的成员，进而在先天免疫应答中起着重要作用。IL-33被表达在内皮细胞和成纤维细胞中，与核中的染色质共同定位12。IL-33的释放伴随细胞损伤13和生物力学过载14，且因此IL-33被认为是‘警戒素(alarmin)’15。它牵涉多种炎症病变，包括肺部、皮肤和关节疾病16。IL-33经由其同源受体ST2(其以膜结合形式(mST2)或可溶形式(sST2)存在)起作用并且经由经典IL-1R信号级联发出信号。细胞因子经常通过微小RNA(miRNA)调节在转录后水平，所述微小RNA通过翻译抑制和靶mRNA的去稳定来控制基因表达17。微小RNA网络出现作为组织修复的关键稳态调节物，其中基础作用体现在干细胞生物学、炎症、低氧反应以及血管发生中18。微小RNA(miR)是小的非编码RNA，它通过阻遏翻译(通过抑制翻译或诱导mRNA降解)而对细胞功能产生显著影响。微小RNA衍生自通过RNA聚合酶II合成的初级RNA转录物(pri-miRNA)，所述初级RNA转录物的长度可以是数千个核苷酸。单一pri-miRNA转录物可以产生多于一个活性miRNA。在核中，III型RNA酶Drosha将pri-miRNA转录物处理为前体miRNA(pre-miRNA)，所述前体miRNA由茎-环或发夹结构组成，长度正常为70至100个核苷酸左右。pre-miRNA之后运送到细胞质，在其中所述pre-miRNA进一步通过RNA酶Dicer处理，从而去除环并且产生成熟的双链miRNA分子，活性“引导”链(长度典型地为15至25个核苷酸)与全部或部分互补的“过客”链杂交。成熟的双链miRNA之后结合到RNA诱导沉默复合体中，在其中引导链与靶mRNA中的结合位点杂交。引导链与靶结合位点可能不完全互补。然而，引导链中指定为“种子”序列的区域通常与靶结合位点的对应序列完全互补。种子序列的长度典型地为2至8个核苷酸，并且所述种子序列位于引导链的5’端处或其附近(在其1或2个核苷酸范围内)。认为单一未配对的引导链还可能能够结合到RISC中。还认为阻止过客链结合到RISC中的对过客链(例如，糖、碱基或主链结构)的修饰也可以提高双链miRNA靶抑制的效率。专利技术概述肌腱损伤的愈合往往欠佳，这至少部分是因为胶原合成在肌腱病期间从1型转变为3型。3型胶原在力学上不如1型胶原，从而导致肌腱具有较低的抗张强度。如果胶原亚型之间的平衡可以往回朝向1型胶原调整，那么肌腱的生物力学特性将会得到改进。先前已将miR-29鉴别为是多种生物过程诸如纤维化和硬皮病中胶原合成的调节物。然而，专利技术人已发现(为首次)肌腱细胞包含1型胶原转录物的替代性剪接形式。1a1型和1a2型胶原的主要转录物具有短的不包含miR-29结合位点的3’未翻译区域(UTR)，而存在的绝大多数3型胶原转录物是长的miR-29敏感形式。因此，肌腱细胞中1型胶原的合成受miR-29影响的程度远远低于3型胶原的合成。出人意料地是，之后通过上调miR-29活性，有可能将胶原亚型之间的平衡调整成有利于1型胶原，从而缓解或消除肌腱的抗张强度的降低，并且调整其生物力学特性诸如其最终的断裂强度。在最广泛的形式中，本专利技术涉及微小RNA 29(miR-29)及其前体、模拟物和激动剂用于调整肌腱愈合和肌腱的生物力学特性的用途。因此，本专利技术提供一种用于调整肌腱愈合的方法，所述方法包括提高肌腱细胞中的miR-29的表达或活性。这可以通过以下方式来实现：向靶细胞直接递送miR-29；递送miR-29模拟物；或递送前体分子，所述前体分子在靶细胞内经处理成为活性miR-29或miR-29模拟物。所述方法可以包括向肌腱细胞递送miR-29、其模拟物、或它们任一者的前体的步骤。miR-29、模拟物或前体可以联合合适的载体分子，诸如药学上可接受的脂质或聚合物(例如，与之复合或由其胶囊化)一起递送。载体分子还可以包含能够结合至靶细胞的表面的靶向剂。所述方法可以包括以下步骤：向肌腱细胞递送编码miR-29、其模拟物或它们任一者的前体的核酸，以使得所述miR-29、模拟物或前体被表达在肌腱细胞中。可替代地，所述方法可以包括向肌腱细胞递送能够上调内源性miR-29活性的激动剂的步骤。所描述的任何方法可以体外、体内或离体执行。最典型的是，所述方法将是通过向受试者施用合适的组合物来体内执行。本专利技术还提供用于调整肌腱愈合的方法中的miR-29、其模拟物或它们任一者的前体。本专利技术还提供miR-29、其模拟物或它们任一者的前体在制造用于调整肌腱愈合的药剂中的用途。本专利技术还提供一种用于调整肌腱愈合的方法中的编码miR-29、其模拟物或它们任一者的前体的核酸。本专利技术还提供编码miR-29、其模拟物或它们任一者的前体的核酸在制造用于调整肌腱愈合的药剂中的用途。在任何方面，miR-29可以是miR-29a、miR-29b(b1和/或b2)、miR-29c或其任何组合。可能希望miR-29是miR-29a或包含miR-29a的组合。编码miR-96、模拟物或前体的核酸可以作为裸露的核酸递送。可替代地，它们可以联合合适的载体分子，诸如药学上可接受的脂质或聚合物或其组合(例如，与之复合或由其胶囊化)一起递送。在任一种情况下，核酸典型地是DNA。载体分子还可以包含能够结合至靶细胞的表面的靶向剂。可替代地，编码miR-96、模拟物或前体的核酸可以通过病毒载体来递送。可以采用任何合适类型的病毒载体，包括腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(尤其是慢病毒)以及疱疹病毒载体。腺病毒和慢病毒可能是特别优选的，因为它们有能力实现未活跃地分裂的细胞中递送的基因的表达。miR-29及其前体人体中的三个主要同工型是miR-29a、miR-29b1、miR-29b2以及miR-29c。术语“miR-29”在本说明书中用于指代由这三种同工型中的任一种的成熟的“引导链”序列组成的RNA寡核苷酸。成熟的人miR-29a(“hsa-miR-29a”)具有以下序列：UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA。成熟的miR-29b1和miR-29b2(“hsa-miR-29b1”和“hsa-miR-29b2”)是相同的并且具有以下序列：UAGCA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于调整受试者的肌腱愈合的方法，所述方法包括增加肌腱细胞中的miR‑29的表达或活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.14 GB 1400598.71.一种用于调整受试者的肌腱愈合的方法，所述方法包括增加肌腱细胞中的miR-29的表达或活性。2.根据权利要求1所述的方法，其包括向肌腱细胞递送miR-29、其模拟物、或它们任一者的前体的步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述miR-29模拟物或前体包含一个或多个修饰的糖残基。4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述miR-29模拟物或前体包含一个或多个修饰的核苷间连键。5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述miR-29模拟物或前体包含一个或多个修饰的碱基。6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述miR-29模拟物或前体包含膜转运部分。7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述miR-29、模拟物或前体与载体缔合(例如，与之复合或由其胶囊化)。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述载体包括药学上可接受的脂质或聚合物。9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述载体分子包含能够结合至靶细胞的表面的靶向剂。10.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：向肌腱细胞递送编码miR-29、其模拟物或它们任一者的前体的核酸，以使得所述miR-29、模拟物或前体被表达在所述肌腱细胞中。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸与载体缔合(例如，与之复合或由其胶囊化)。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述载体包括药学上可接受的脂质或聚合物。13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述载体分子包含能够结合至靶细胞的表面的靶向剂。14.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸经由病毒载体来递送。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒或疱疹病毒载体。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。17.根据权利要求2至16中任一项所述的方法，其中所述miR-29是miR-29a、miR-29b1、miR29b2或miR-29c或者其组合。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述组合包含miR-29a。19.根据权利要求2至18中任一项所述的方法，其中所述miR-29或其模拟物包含引导链，所述引导链包含种子序列AGCACCA。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述引导链包含以下序列：UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA(hsa-miR-29a)；UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU(hsa-miR-29b1；hsa-miR-29b2)；或UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA(hsa-miR-29c)。21.根据权利要求2至20中任一项所述的方法，其中所述前体是pre-mir-29。22.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·S·吉尔克里斯特，N·L·米勒，
申请(专利权)人：格拉斯哥大学大学行政评议会，
类型：发明
国别省市：英国;GB