使用可编程DNA结合蛋白增强靶向基因组修饰制造技术

使用可编程DNA结合蛋白来增加靶向基因组修饰的效率和/或特异性或促进真核细胞中特定基因组位点的检测的组合物和方法。基因组位点的检测的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
使用可编程DNA结合蛋白增强靶向基因组修饰


[0001]本公开内容涉及用于提高靶向基因组修饰的效率和/或特异性的组合物和方法。

技术介绍

[0002]可编程核酸内切酶越来越成为真核生物中靶基因组工程或修饰的重要工具。最近，RNA引导的成簇规律间隔的短回文重复(CRISPR)/CRISPR
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相关的(Cas)(CRISPR/Cas)系统已作为新一代基因组修饰工具出现。与前几代核酸酶，例如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)相比，这些新的可编程核酸内切酶大大提高了基因组编辑能力。
[0003]然而，并非所有基因组靶标都可通过这些可编程核酸内切酶进行有效修饰。事实上，一些CRISPR
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Cas核酸内切酶似乎在人类细胞中几乎没有或没有活性。染色质结构尤其可能成为这些可编程核酸内切酶的障碍并阻止它们与靶序列结合。因此，需要改进这些可编程核酸内切酶对靶序列的可及性和/或提高靶向基因组修饰的效率。此外，需要通过降低脱靶效应来增加靶向基因组修饰的特异性。

技术实现思路

[0004]在本公开内容的多个方面中包括一种组合物，其包含(a)可编程DNA修饰蛋白或编码可编程DNA修饰蛋白的核酸和(b)至少一种可编程DNA结合蛋白或编码至少一种可编程DNA结合蛋白的核酸。通常，可编程DNA修饰蛋白具有核酸酶活性(即切割双链序列的两条链)或非核酸酶活性(例如表观遗传修饰活性或转录调节活性)和所述至少一种可编程DNA结合蛋白缺乏核酸酶活性。
[0005]在可编程DNA修饰蛋白具有核酸酶活性的实施方案中，例如可编程DNA修饰蛋白可选自RNA引导的成簇规律间隔的短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)(CRISPR/Cas)核酸酶系统、CRISPR/Cas双切口酶系统、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(meganuclease)、包含与核酸酶结构域(即产生双链DNA断裂)连接的可编程DNA结合结构域的融合蛋白及其组合。
[0006]在可编程DNA修饰蛋白具有非核酸酶活性的实施方案中，例如可编程DNA修饰蛋白可以是融合蛋白，其包含与非核酸酶修饰结构域连接的可编程DNA结合结构域。在某些实施方案中，融合蛋白的可编程DNA结合结构域可以是无催化活性的CRISPR/Cas系统、无催化活性的大范围核酸酶、锌指蛋白或转录激活因子样效应子，并且融合蛋白的非核酸酶修饰结构域可具有乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、甲基转移酶活性、去甲基酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、豆蔻酰化活性、去豆蔻酰化活性、瓜氨酸化活性、解旋酶活性、氨基化活性、脱氨基化活性、烷基化活性、脱烷基化活性、氧化活性、转录激活活性或转录阻遏活性。在具体的实施方案中，融合蛋白的非核酸酶修饰结构域具有胞嘧啶脱氨酶活性、组蛋白乙酰转移酶活性、转录激活活性或转录阻遏活性。
[0007]根据本文公开的组合物的某些实施方案，所述至少一种可编程DNA结合蛋白可以
是无催化活性的CRISPR/Cas系统、无催化活性的大范围核酸酶、锌指蛋白、转录激活因子样效应子、CRISPR/Cas切口酶、ZFN切口酶、TALEN切口酶或大范围核酸酶切口酶。
[0008]通常，编码可编程DNA修饰蛋白和/或至少一种可编程DNA结合蛋白的核酸是mRNA或DNA。在一些实施方案中，编码可编程DNA修饰蛋白和/或至少一种可编程DNA结合蛋白的核酸是载体的一部分，例如质粒载体、慢病毒载体、腺伴随病毒载体、或腺病毒载体。
[0009]在具体的实施方案中，可编程DNA修饰蛋白包含CRISPR/Cas核酸酶系统、CRISPR/Cas双切口酶系统、或与非核酸酶结构域连接的无催化活性的CRISPR/Cas系统，并且至少一种可编程DNA结合蛋白包含无催化活性的CRISPR/Cas系统，其中每种CRISPR/Cas系统包含CRISPR/Cas蛋白和引导RNA。在多种实施方案中，每种CRISPR/Cas核酸酶系统可以是I型CRISPR/Cas系统、II型CRISPR/Cas系统、III型CRISPR/Cas系统或V型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，每种引导RNA可以至少部分化学合成。在其它实施方案中，每种引导RNA可以至少部分酶促合成。在进一步的实施方案中，编码每种CRISPR/Cas蛋白的核酸可以是mRNA，并且编码每种引导RNA的核酸可以是DNA。在其它的实施方案中，编码每种CRISPR/Cas蛋白的核酸可以是mRNA、并且编码每种引导RNA的核酸可以是DNA。在某些方面中，编码CRISPR/Cas蛋白的核酸和/或编码引导RNA的核酸可以是载体的一部分，例如质粒载体、慢病毒载体、腺伴随病毒载体或腺病毒载体。
[0010]本公开内容的另一方面包括试剂盒，其包含上文详述的任何一种或多种组合物。
[0011]本公开内容的另一方面提供了用于提高真核细胞中靶向基因组修饰效率和/或特异性的方法。所述方法包括向真核细胞中引入(a)可编程DNA修饰蛋白或编码可编程DNA修饰蛋白的核酸和(b)至少一种可编程DNA结合蛋白或编码至少一种可编程DNA结合蛋白的核酸。可编程DNA修饰蛋白靶向于靶染色体序列，并且所述至少一种可编程DNA结合蛋白中的每种都靶向于靶染色体序列附近的位点。所述至少一种可编程DNA结合蛋白与靶染色体序列附近位点的结合提高了可编程DNA修饰蛋白对靶染色体序列的可及性，从而提高靶向基因组修饰效率和/或特异性。由至少一种可编程DNA结合蛋白中的每种结合的附近位点都位于例如靶染色体序列任一侧的约250个碱基对内。在一些实施方案中，附近结合位点位于靶染色体序列的任一侧的小于约200bp或小于约100bp。
[0012]所述方法中使用的可编程DNA修饰蛋白可以是CRISPR/Cas核酸酶系统、CRISPR/Cas双切口酶系统、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、包含与核酸酶结构域连接的可编程DNA结合结构域的融合蛋白，或包含与非核酸酶结构域连接的可编程DNA结合结构域的融合蛋白。所述融合蛋白的可编程DNA结合结构域可以是无催化活性的CRISPR/Cas系统、无催化活性的大范围核酸酶、锌指蛋白或转录激活因子样效应子，并且融合蛋白的非核酸酶修饰结构域可具有乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、甲基转移酶活性、去甲基酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、豆蔻酰化活性、去豆蔻酰化活性、瓜氨酸化活性、解旋酶活性、氨基化活性、脱氨基化活性、烷基化活性、脱烷基化活性、氧化活性、转录激活活性或转录阻遏活性。在具体的实施方案中，融合蛋白的非核酸酶修饰结构域具有胞嘧啶脱氨酶活性、组蛋白乙酰转移酶活性、转录激活活性或转录阻遏活性。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合物，包含：(a)可编程DNA修饰蛋白或编码可编程DNA修饰蛋白的核酸，其中所述可编程DNA修饰蛋白是RNA引导的成簇规律间隔的短回文重复(CRISPR)核酸酶系统；(b)至少一种可编程DNA结合蛋白或编码至少一种可编程DNA结合蛋白的核酸，其中所述至少一种可编程DNA结合蛋白是缺乏核酸酶活性的CRISPR系统；和(c)包含供体序列的供体多核苷酸；其中各个CRISPR系统包含CRISPR蛋白和引导RNA；其中所述可编程DNA修饰蛋白靶向于靶染色体序列，并且至少一种可编程DNA结合蛋白中的每种都靶向于靶染色体序列任一侧的约250个碱基对内的位点；和其中每种CRISPR蛋白是II型CRISPR蛋白或V型CRISPR蛋白。2.权利要求1的组合物，其中至少一种可编程DNA结合蛋白靶向于靶染色体序列任一侧的约100个碱基对内的位点。3.权利要求2的组合物，其中至少一种可编程DNA结合蛋白靶向于靶染色体序列任一侧的约75个碱基对内的位点。4.权利要求3的组合物，其中至少一种可编程DNA结合蛋白靶向于靶染色体序列任一侧的约50个碱基对内的位点。5.权利要求4的组合物，其中至少一种可编程DNA结合蛋白靶向于靶染色体序列任一侧的约25个碱基对内的位点。6.权利要求1
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5中任一项的组合物，其中缺乏核酸酶活性的CRISPR系统是无催化活性的CRISPR蛋白。7.权利要求1至6中任一项的组合物，其中编码每种CRISPR蛋白的核酸是mRNA或DNA。8.权利要求1至7中任一项的组合物，其中编码每种CRISPR蛋白的核酸和/或编码每种引导RNA的核酸是质粒载体或病毒载体的一部分。9.权利要求1至8中任一项的组合物，其中每种CRISPR系统的引导RNA至少部分是化学合成的。10.权利要求1至9中任一项的组合物，其中每种CRISPR系统的引导RNA是酶促合成的。11.一种试剂盒，其包含权利要求1至10中任一项的组合物。12.一种用于在真核细胞中靶向基因组修饰的体外或离体方法，所述方法包括向真核细胞中引入：(a)可编程DNA修饰蛋白或编码可编程DNA修饰蛋白的核酸，其中所述可编程DNA修饰蛋白是RNA引导的成簇规律间隔的短回文重复(CRISPR)核酸酶系统；(b)至少一种可编程DNA结合蛋白或编码至少一种可编程DNA结合蛋白的核酸，其中所述至少一种可编程DNA结合蛋白是缺乏核酸酶活性的CRISPR系统；和(c)包含供体序列的供体多核苷酸；其中各个CRISPR系统包含CRISPR蛋白和引导RNA；其中所述可编程DNA修饰蛋白靶向于靶染色体序列，并且至少一种可编程DNA结合蛋白中的每种都靶向于靶染色体序列附近的位点；其中所述至少一种可编程DNA结合蛋白与靶染色体序列附近位点的结合提高可编程DNA修饰蛋白对靶染色体序列的可及性，从而提高靶向基因组修饰效率和/或特异性；
其中每种CRISPR蛋白是II型CRISPR蛋白或V型CRISPR蛋白；和其中所述靶染色体序列附近的位点位于所述靶染色体序列任一侧的约250个碱基对内，其中所述方法不包括用于修饰人类生殖细胞系遗传身份的方法或者人胚胎的工业或商业目的的应用。13.权利要求12的方法，其中所述靶染色体序列附近的位点位于所述靶染色体序列任一侧的约100个碱基对内。14.权利要求13的方法，其中所述靶染色体序列附近的位点位于所述靶染色体序列任一侧的约75个碱基对内。15.权利要求14的方法，其中所述靶染色体序列附近的位点位于所述靶染色体序列任一侧的约50个碱基对内。16.权利要求15的方法，其中所述靶染色体序列附近的位点位于所述靶染色体序列任一侧的约25个碱基对内。17.权利要求12
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16中任一项的方法，其中缺乏核酸酶活性的CRIS...

【专利技术属性】
技术研发人员：F陈，
申请(专利权)人：西格马奥尔德里奇有限责任公司，
类型：发明
国别省市：