用于添加适配体至核酸的方法及用于实施所述方法的组合物技术

提供了添加适配体至核酸的方法。所述方法包括合并模板核糖核酸(RNA)、包括3'杂交结构域和测序平台适配体构建体的模板转换寡核苷酸、聚合酶和dNTP于反应混合物中。将反应混合物组分在足以产生包括模板RNA和模板转换寡核苷酸的产物核酸的条件下合并，所述模板RNA和模板转换寡核苷酸各自杂交至单一产物核酸的相邻区(包括通过聚合酶从dNTP聚合的区)。本发明专利技术的各方面另外包括组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年10月17日提交的美国临时专利申请序列No.61/892,372和2014年4月15日提交的美国临时专利申请序列No.61/979,852的申请日期的优先权；所述申请的公开内容通过引用并入本文。引言大规模并行(或“下一代”)测序平台快速转化基因组、表观基因组和转录组研究中的数据收集和分析。某些测序平台，诸如由IonTorrentTM、RocheTM和LifeTechnologiesTM销售的那些，涉及未知序列的多核苷酸的固相扩增。这些多核苷酸的固相扩增通常通过首先连接已知的适配体序列至多核苷酸的每个末端进行。然后使双链多核苷酸变性以形成单链模板分子。使模板的3'末端的适配体序列杂合至固定在固体基质上的延伸引物，并且扩增通过延伸固定的引物进行。在通常被称为“桥PCR”中，与模板的5'末端相同的第二经固定的引物用作反向引物，从而使得正向链和反向链的扩增在固体基质如珠粒或流动池表面上进行。用于对适配体添加测序的基于连接的方法的劣势是涉及的步骤的数目，包括可开始固相扩增之前制备靶多核苷酸所需的酶促步骤和洗涤步骤。作为一个实例，在连接适配体序列之后，未使用的适配体分子必需从连接的多核苷酸分离，之后添加混合物至流动池。否则，未使用的适配体分子还可杂交至经固定的引物，从而防止引物有效杂交至模板分子及随后的延伸。基于连接的方法的另一个缺陷是其缺乏方向性，这使得在核酸不同末端处具有不同适配体很难。此外，此类方法的灵敏度较低并使得它们在仅少量样品材料可用的情况下不适用。概述提供了添加适配体至核酸的方法。所述方法包括在反应混合物中组合模板核糖核酸(RNA)、模板转换核酸(如模板转换寡核苷酸)(包括3'杂交结构域和测序平台适配体构建体)、聚合酶及dNTP。将反应混合物组分在足以产生包括模板RNA和模板转换寡核苷酸的产物核酸的条件下合并，所述模板RNA和模板转换寡核苷酸各自杂交至单一产物核酸的相邻区(包括通过聚合酶从dNTP聚合的区)。本专利技术的各方面还包括组合物和试剂盒。附图详述图1示意性示出用于产生具有根据本公开的一个实施方案的适配体构建体的核酸的基于模板转换的方法。在该实施方案中，具有少于目标测序平台所必需的所有核酸结构域的适配体构建体通过模板-转换聚合反应提供。剩余的核酸结构域通过聚合酶链式反应(PCR)使用包括剩余结构域的扩增引物提供。图2示意性示出用于产生具有根据本公开的一个实施方案的适配体构建体的核酸的基于模板转换的方法。在该实施方案中，在模板-转换聚合反应期间提供包括目标测序平台所必需的所有核酸结构域的适配体。图3示意性示出用于产生具有根据本公开的一个实施方案的适配体构建体的核酸的基于模板转换的方法。在该实施方案中，非-多腺苷酸化RNA用作原料。将非-多腺苷酸化RNA腺苷酸化并且腺苷酸化RNA在产生具有适配体构建体的核酸的模板-转换聚合反应中用作供体模板。图4是显示cDNA文库可使用本公开的方法用各种量的输入RNA产生的图。根据该实施方案，组成文库的cDNA具有能够通过目标测序平台对cDNA测序的适配体构建体。图5显示了根据本公开的一个实施方案的适配体构建体。在该实施方案中，所述构建体包括P5、P7、Read1、Read2和索引结构域，其能够对对应于测序平台上的模板RNA的cDNA进行配对-末端测序。图6显示了使用根据本公开的一个实施方案的方法产生的测序数据与使用分开的cDNA扩增和文库制备步骤的传统方法产生的测序数据的比较。详述提供了添加适配体至核酸的方法。所述方法包括在反应混合物中组合模板核糖核酸(RNA)、模板转换寡核苷酸(包括3'杂交结构域和测序平台适配体构建体)、聚合酶和dNTP。将反应混合物组分在足以产生包括模板RNA和模板转换寡核苷酸的产物核酸的条件下合并，所述模板RNA和模板转换寡核苷酸各自杂交至单一产物核酸的相邻区(包括通过聚合酶从dNTP聚合的区)。本专利技术的各方面还包括组合物和试剂盒。在详细描述本公开的方法之前，应理解所述方法不限于所述的特定实施方案，因此当然可以发生变化。还应当理解，本文所用的术语只是为了描述特定实施方案，并非旨在进行限制，因为本专利技术的范围将只由所附权利要求书限定。当提供数值范围时，应理解该范围的上限和下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定)以及所述范围内的任意其它所述或居间的数值都涵盖在本方法中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小的范围内，并且也涵盖在本方法中，服从于所述范围内的任何特别排除的限值。当所述范围包括上下限值之一或两者时，排除那些所包括的界限之一或两者的范围也包括在本方法中。本文中提供了某些在数值之前加有术语“约”的范围。术语“约”在本文中用于为其之后的确切数字以及与所述术语之后的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否与明确引用的数字接近或近似中，接近或近似的未引用的数字可以是在其出现的上下文中提供明确引用的数字的基本等同物的数字。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本方法所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料也可用于实践或检验本专利技术，但现在描述代表性说明方法和材料。本说明书中引用的所有公布和专利通过引用并入本文，就如同特定地及个别地表明各个公布或专利通过引用并入，并且通过引用并入本文以公开和描述与公布一起被引用的方法和/或材料。任何公布的引用是针对其提交日期之前的公开内容，并且不应当解释为本专利技术无权先于因先前专利技术所作的此类披露。此外，提供的公布的日期可与可能需要独立确认的实际公布日期不同。应指出的是，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文明确地另有说明，否则单数形式“一种/个(a)”、“一种/个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。还应指出，可撰写权利要求来排除任何可选元素。这样，该陈述意图用作与权利要求要素的引用联合使用此类排他性术语“单独地”、“仅仅”等或使用“否定(negative)”限制的在先基础。应理解，也可在单个实施方案中组合地提供本专利技术的某些特征，所述特征为清楚起见描述于分开的实施方案的上下文中。反之，为简明起见而在单个实施方案的语境中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，其包括：在足以产生产物核酸的条件下合并：模板核糖核酸(RNA)；包括3'杂交结构域和测序平台适配体构建体的模板转换寡核苷酸；聚合酶；和dNTP；于反应混合物中，所述产物核酸包括各自杂交至单一产物核酸的相邻区的所述模板RNA和所述模板转换寡核苷酸，所述单一产物核酸的相邻区包括由所述聚合酶从所述dNTP聚合的区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.17 US 61/892,372;2014.04.15 US 61/979,8521.一种方法，其包括：
在足以产生产物核酸的条件下合并：
模板核糖核酸(RNA)；
包括3'杂交结构域和测序平台适配体构建体的模板转换寡核苷
酸；
聚合酶；和
dNTP；
于反应混合物中，所述产物核酸包括各自杂交至单一产物核酸的
相邻区的所述模板RNA和所述模板转换寡核苷酸，所述单一产物核
酸的相邻区包括由所述聚合酶从所述dNTP聚合的区。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板RNA是信使
RNA(mRNA)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板RNA是非-多腺
苷酸化RNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括添加核酸序
列至所述非-多腺苷酸化RNA的3’末端。
5.根据权利要求4所述的方法，其中添加至所述非-多腺苷酸化
RNA的3’末端的所述核酸序列是多腺嘌呤序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测序平台
适配体构建体包括选由以下组成的组的核酸结构域：特异性结合至表

\t面-连接的测序平台寡核苷酸的结构域、测序引物结合结构域、条形
码结构域、条形码测序引物结合结构域、分子鉴定结构域及其组合。
7.根据前述权利要求中任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：克雷格·贝茨，史蒂夫·欧，乔治·乔克哈兹，
申请(专利权)人：克隆技术实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US