本发明专利技术涉及一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，包含CD30结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述CD30结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术还涉及编码所述嵌合抗原受体的核酸，还涉及表达所述嵌合抗原受体的重组表达载体。通过将本发明专利技术的嵌合抗原受体表达于T细胞中可使得到CAR T细胞能够有效并且特异性地靶向表达CD30表面抗原的恶性细胞，从而为治疗一些表达CD30表面抗原的肿瘤，例如霍奇金淋巴瘤等，提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞免疫治疗领域，更特别地，涉及一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体及其编码序列和表达载体。
技术介绍
CD30是霍奇金淋巴瘤和一些非霍奇金淋巴瘤的恶性细胞常常表达的细胞表面抗原，因此，在治疗这类疾病时，最好能够使用可靶向CD30的药物或疫苗。细胞免疫治疗是一种正在兴起的肿瘤治疗方法，其通过分子生物学技术构建嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)的表达载体，并将该表达载体导入到从人体分离的免疫细胞中，使其细胞表面表达CAR后，将其回输至人体。表达CAR的免疫细胞能够特异性识别靶细胞，并对其进行杀伤。在这种治疗方法中，CAR的作用至关重要。嵌合抗原受体包括单链抗体结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域。其中，单链抗体结构域将免疫细胞靶向目标细胞，胞内信号结构域释放胞内信号，启动免疫细胞的杀伤活性。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，包含CD30结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述CD30结合结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。优选地，所述跨膜结构域为CD8，其氨基酸序列序列如SEQIDNO:2所示。优选地，所述细胞内信号结构域由CD28、4-1BB和CD3组成，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还提供了一种编码上述嵌合抗原受体的核酸，其序列如SEQIDNO:4所示。本专利技术还提供了一种表达上述嵌合抗原受体的重组表达载体，其包括嵌合抗原受体表达框和复制系统，所述嵌合抗原受体表达框由可在T细胞中表达的启动子和位于所述启动子下游的编码所述嵌合抗原受体的核酸组成。优选地，所述启动子为巨细胞病毒启动子、SV40启动子、EF1alpha启动子或RSV启动子。优选地，所述重组表达载体通过将所述编码嵌合抗原受体的核酸插入慢病毒表达载体中的CMV启动子得到。通过将本专利技术的嵌合抗原受体表达于T细胞中可使得到CART细胞能够有效并且特异性地靶向表达CD30表面抗原的恶性细胞，从而为治疗一些表达CD30表面抗原的肿瘤，例如霍奇金淋巴瘤等，提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。附图说明图1为实施例中编码CD30嵌合抗原受体的DNA片段的示意图；图2为CART细胞、GART细胞和T细胞对高表达CD30的霍奇金淋巴瘤细胞的杀伤活性统计图；图3为CART细胞、GART细胞和T细胞对不表达CD30的人成纤维细胞BJ的杀伤活性统计图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.CD30SCFV嵌合抗原受体表达质粒的构建通过人工合成SEQIDNO:4所示的长度为1623bp的DNA片段，其中，第1-819位的核苷酸编码CD30SCFV，第820-954位的核苷酸编码CD8铰链区，第955-1158位的核苷酸编码CD28，第1159-1284位的核苷酸编码41BB，第1285-1623位的核苷酸编码CD3。后面三个区域构成胞内信号区。将上述DNA片段插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-puro的CMV启动子下游，得到CD30SCFV嵌合抗原受体表达质粒。2.CD30SCFV嵌合抗原受体表达质粒转染T细胞1)慢病毒的包装制备将CD30SCFV嵌合抗原受体表达质粒和辅助质粒psPAX2、pMD2.G以4:3:1的比例用lipo2000转染试剂(Invitrogen)转染，具体方法见lipo2000转染试剂说明书。转染48小时后，将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃2000g离心10min，转移上清至新EP管中，0.45μm滤器过滤后-80℃保存.2)T细胞的制备取10ml健康人的新鲜血液，用淋巴细胞分离液(Mediatech)分离外周血单核细胞，具体方法见说明书。用含有300IU/ml的IL-2、50ng/ml的OKT-3和5％人AB血清(Invitrogen)的AIM-V培养基(Invitrogen)诱导培养48h，得到T细胞。3)慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养从-80℃取出2ml病毒液，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(购自Sigma公司)，用该病毒液重悬1×106个上述诱导培养的T细胞。将细胞悬液加入24孔板的1个孔中，1000g，32℃，离心1h。37℃，5％CO2培养箱内培养8h后，1000g，32℃，再次离心1h。吸弃1.4ml培养上清，加入1.4ml新鲜的含有300IU/ml的IL-2、50ng/ml的OKT-3和5％人AB血清的AIM-V培养基，继续培养。每2-3天检测一次细胞密度，当细胞密度达到2×106个/ml时，吸取1ml细胞悬液，加入另一个孔中，分别向两个孔中加入1ml新鲜的含有300IU/ml的IL-2和5％人AB血清的AIM-V培养基，继续扩大培养。如此反复，直至细胞扩增至足够的用量。检验CD30SCFV嵌合抗原受体在T细胞中有效表达后，即获得针对CD30的CART细胞。3.CART细胞的对CD30阳性的恶性细胞的特异性杀伤活性分别取5×104个霍奇金淋巴瘤细胞(高表达CD30)和人成纤维细胞BJ接种于96孔板，过夜培养后，分别向两种细胞培养孔中按效应细胞(E)：靶细胞(T)＝10:1和3:1的比例加入CAR-T细胞、对照病毒修饰的T细胞(GFP-T)和未加修饰的T细胞(T)。孵育5h后，按照LDH细胞毒性分析试剂盒(CaymanChemical)说明书进行操作，检测CART细胞对霍奇金淋巴瘤细胞的特异杀伤活性。结果显示CART细胞组与GFP-T组和T细胞组相比，在效靶比为10:1和3:1的情况下，对高表达CD30的霍奇金淋巴瘤细胞都具有更强的杀伤作用，且这种差异具有显著性(p<0.05)(图1)；对不表达CD30的人成纤维细胞BJ的杀伤作用无显著性差异(p>0.05)(图2)。因此CART细胞对高表达CD30的肿瘤细胞具有特异杀伤活性。上所述仅为本专利技术的较佳实施例，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。序列表<110>武汉波睿达生物科技有限公司<120>一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体<130>1<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>248<212>PRT<213>人工序列<400>1GlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuAlaArgProGlyAlaSerVal151015LysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrThrTyrThrIle202530HisTrpValArgGlnArgProGlyHisAspLeuGluTrpIleGlyTyr354045IleAsnProSerSerGlyTyrSerAspTyrAsnGlnAsnPheLysGly505560LysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerAsnThrAlaTyrMetGl本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，包含CD30结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述CD30结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种靶向表达CD30表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，包含CD30结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述CD30结合结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD8，其氨基酸序列序列如SEQIDNO:2所示。3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述细胞内信号结构域由CD28、4-1BB和CD3组成，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。4.一种编码权利要1-3中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸，其特征在于，序...
【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，胡广，顾潮江，柳浥时，廖兴华，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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