本发明专利技术公开了一种Slit2D2多肽与人血清白蛋白HSA融合形成的融合蛋白Slit2D2‑HSA及其在制备预防和/或治疗脓毒症的药物中的应用，所述融合蛋白Slit2D2‑HSA在保持Slit2抑制中性粒细胞迁移、治疗脓毒症的药理活性的基础上，提高了稳定性，延长了半衰期，有助于提高对脓毒症的治疗效果，且Slit2D2多肽与Slit2蛋白相比，分子量小，在制备时易于纯化和分离，更容易用于药物的开发。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及脓毒症治疗药物领域，尤其涉及融合蛋白Slit2D2-HSA在预防和/或治疗脓毒症药物中的应用。
技术介绍
脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)，其感染源包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等。脓毒症也常常发生在有严重疾病的患者中，如严重烧伤、多发伤、外科手术后等患者。脓毒症按严重程度可分脓毒症、严重脓毒症(severesepsis)和脓毒性休克(septicshock)。脓毒症发生率高，全球每年有超过1800万严重脓毒症病例，美国每年有75万例脓毒症患者，并且这一数字还以每年1.5％～8.0％的速度上升。脓毒症的病情凶险，病死率高，全球每天约14,000人死于其并发症，美国每年约21.5万人死亡。据国外流行病学调查显示，脓毒症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒症的病死率仍高达30％～70％。脓毒症治疗花费高，医疗资源消耗大，严重影响人类的生活质量，已经对人类健康造成巨大威胁。中性粒细胞在抵抗感染中具有重要作用，机体发生感染后，中性粒细胞会被快速从骨髓中动员和；募集到炎症部位，它可以释放包括蛋白水解酶、活性氧、细胞因子等物质，用于清除病原微生物，在该过程中如果反应过激则会造成机体损伤，严重情况下会引起组织器官功能损伤或衰亡，进而出现严重脓毒症(severesepsis)或脓毒性休克(septicshock)。神经迁移蛋白Slit是一种在进化上高度保守的分泌型细胞外基质糖蛋白，分子量约为200kD，对轴突生长和神经元迁移起导向作用，哺乳类动物中克隆到的Slit基因有三个，分别命名为Slit1，Slit2和Slit3，其结构由N端的胞外分泌信号肽，4个富含亮氨酸的重复序列(leucine-richrepeat，LRRs)，也被命名为D1-D4结构域，多个EGF(epidermalgrowthfactor)样的重复序列(在果蝇中是7个，在脊椎动物中是9个)，一个lamininG样结构域和一个富含半胱氨酸的C端结构域组成，其中以Slit2最为重要。Robo蛋白家族是Slit的受体家族，是一种单通道的跨膜受体，Slit蛋白通过结合受体Robo发挥功能，LRRs是Slit蛋白和受体Robo的结合区域。目前已有文献表明，Slit2蛋白可能会抑制中性粒细胞的迁移。研究发现Slit蛋白在血管生成、肿瘤细胞迁移、白细胞趋化等方面发挥重要作用，美国专利US8399404B2使用Slit蛋白和核酸用于治疗血小板凝血和其他相应障碍，并公开了一种使用Slit蛋白包衣的血管装置和可表达Slit蛋白的细胞。专利WO2009105457公开了一种癌症诊断、研究和治疗的方法和组合物，涉及以Slit2蛋白作为肿瘤标记物有效用作诊断标记物和前列腺癌的临床目标。Tole等通过研究发现Slit2蛋白通过抑制趋化因子引起的肌动蛋白刺端形成和细胞极化来抑制中性粒细胞的迁移(Theaxonalrepellent,Slit2,inhibitsdirectionalmigrationofcirculatingneutrophils.JLeukocBiol.2009,86(6):1403-15)。Hohenester发现Slit与其受体Robo相结合是通过前者的D2域与后者的IG1的结合实现的(StructuralinsightintoSlit-Robosignaling.BiochemicalSocietyTransactions.2008,36:251-256)，因此D2域对Slit蛋白发挥其生理活性非常重要。中国专利CN201310150884.4利用基因重组技术制备了一种Slit2蛋白的D1-2序列的融合蛋白，该融合蛋白有助于LRR正确折叠，形成有活性的功能多肽，用于Slit2蛋白的研究和应用。分子量小于20kD的蛋白类的药物在代谢过程中易被肾小球滤过，导致其体内半衰期较短，为了达到治疗效果，往往需要频繁或大剂量给药，给患者带来极大的不便。人血清白蛋白(HSA)是一个稳定的“惰性”蛋白，在正常生理状况下不易透过肾小球，在血清中的半衰期达14-21天，可以作为一种载体与血液中的其他因子，包括生物活性蛋白结合，从而保持或延长其他因子在体内的生物活性。将一些小分子肽或蛋白质药物与HSA进行融合是改进小分子肽或蛋白质药物半衰期的有效方法。与其他方法相比，构建长效白蛋白融合蛋白药物可以避免复杂的化学修饰和处理过程，因而具有容易操作和更好的经济性优势。因此，为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供一种预防和/或治疗脓毒症的融合蛋白及其应用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种预防和/或治疗脓毒症的融合蛋白，解决了现有生物药物分子量大、半衰期短、不利于药物开发的缺陷。本专利技术的另一目的是提供一种预防和/或治疗脓毒症的药物，具有良好的治疗效果，能够提高患者的存活率。因此，本专利技术的第一方面提供了一种融合蛋白，由Slit2蛋白D2结构域和HSA蛋白融合形成。本专利技术所述的Slit2蛋白D2结构域，简称Slit2D2，具有：a)如SEQIDNo：1所示的氨基酸序列，或b)将a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列；本专利技术所述的HSA蛋白具有：c)如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，或d)将c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。优选的，所述的融合蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。本专利技术所述的Slit2蛋白D2结构域通过C末端与HSA蛋白的N末端直接连接，或Slit2蛋白D2结构域通过其N末端与HSA蛋白的C末端直接连接，即Slit2蛋白D2结构域与HSA蛋白直接连接，中间没有任何连接肽。本专利技术所述的融合蛋白Slit2D2-HSA的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，或者，是将SEQIDNO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。本专利技术还提供一种编码所述的融合蛋白Slit2D2-HSA的基因，其中所述的Slit2蛋白D2结构域的基因序列如SEQIDNO：4所示，所述的HSA蛋白的基因序列如SEQIDNO：5所示，所述的融合蛋白Slit2D2-HSA的基因序列如SEQIDNO：6所示。或者，在严格条件下与SEQIDNO：6所示的序列杂交且编码具有预防和/或治疗脓毒症功能的相关蛋白的DNA分子；或者，与SEQIDNO：6所示的序列具有至少90％以上，优选为95％以上，更优选为98％以上同源性且编码具有预防和/或治疗脓毒症功能的相关蛋白的DNA分子。本专利技术还提供了一种与融合蛋白Slit2D2-HSA相关的生物材料，包括含有本专利技术所述融合蛋白Slit2D2-HSA编码基因的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌、重组病毒。优选的，本专利技术所述的重组载体为重组表达载体或重组克隆本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白Slit2D2‑HSA，其特征在于，所述的融合蛋白由Slit2蛋白D2结构域和HSA蛋白融合形成，所述的Slit2蛋白D2结构域具有：a)如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，或b)将a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列；所述的HSA蛋白具有：c)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或d)将c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白Slit2D2-HSA，其特征在于，所述的融合蛋白由Slit2蛋白D2结构域和HSA蛋白融合形成，所述的Slit2蛋白D2结构域具有：a)如SEQIDNo：1所示的氨基酸序列，或b)将a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列；所述的HSA蛋白具有：c)如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，或d)将c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。2.权利要求1所述的融合蛋白Slit2D2-HSA，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；或者，是将SEQIDNO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。3.一种编码融合蛋白Slit2D2-HSA的基因，其特征在于，所述的融合蛋白Slit2D2-HSA的基因序列如SEQIDNO：6所示；或者，在严格条件下与SEQIDNO：6所示的序列杂交且编码具有预防和/或治疗脓毒症功能的相关蛋白的DNA分子；或者，与SEQIDNO：6所示的序列具有至少90％以上或95％以上或98％以上同源性且编码具有预防和/或治疗脓毒症功能的相关蛋白的DNA分子。4.包含权利要求3所述的编码融合蛋白Slit2D2-HSA的基因的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒。5.一种权利要求1所述的融合蛋白Slit2D2-HSA的制备方法，其特征在于，包括：(1)重组载体的构建；(2)转化体的制备和发酵；(3)融合蛋白的分离和纯化；任选的，(4)融合蛋白的鉴定。6.权利要求5所述的融合蛋白Slit2D...
【专利技术属性】
技术研发人员：李华顺，
申请(专利权)人：李华顺，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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